Struktura i hemijski sastav
Virus gripa ima sferični oblik, prečnika 80-120 nm. Nitasti oblici su rjeđi. Helikalni nukleokapsid je lanac ribonukleoproteina sa dvostrukom spiralom (RNP) koji čini jezgro viriona. S njim su povezane RNA polimeraza i endonukleaze (P1 i P3). Jezgro je okruženo membranom koja se sastoji od proteina M, koji povezuje RNP sa dvostrukim lipidnim slojem vanjske ljuske i stiloidnim procesima, koji se sastoje od hemaglutinina i neuraminidaze.Virioni sadrže oko 1% RNK, 70% proteina, 24% lipida i 5% ugljenih hidrata. Lipidi i ugljikohidrati dio su lipoproteina i glikoproteina vanjske ljuske i staničnog su porijekla. Genom virusa je predstavljen minus-lančanom fragmentiranom RNK molekulom. Virusi gripa tipovi A i B imaju 8 RNA fragmenata. Od njih 5 kodira po jedan protein, a posljednja 3 kodiraju po dva proteina.Antigeni
Virusi gripa A, B i C razlikuju se jedni od drugih po tip-specifičnom antigenu povezanom sa RNP (NP protein) i proteinu M-matriksa koji stabilizuje strukturu viriona. Ovi antigeni se detektuju u CSC. Užu specifičnost virusa tipa A određuju još dva površinska antigena - hemaglutinin H i neuraminidaza N, označeni serijskim brojevima. Hemaglutinin je kompleksni glikoprotein sa zaštitnim svojstvima. Inducira u tijelu stvaranje antitijela koja neutraliziraju viruse - antihemaglutinina, otkrivenih u RTGA. Promjenjivost hemaglutinina (H-antigena) određuje antigenski drift i pomak virusa gripe. Antigenski drift se podrazumijeva kao manje promjene u H-antigenu uzrokovane tačkastim mutacijama u genu koji kontrolira njegovu formaciju. Takve promjene se mogu akumulirati u potomstvu pod utjecajem selektivnih faktora kao što su antitijela. To u konačnici dovodi do kvantitativnog pomaka, izraženog u promjeni antigenskih svojstava hemaglutinina. Sa antigenskim pomakom dolazi do potpune zamjene gena, koja se može temeljiti na rekombinaciji između dva virusa. To dovodi do promjene podtipa hemaglutinina ili neuraminidaze, a ponekad i oba antigena, te do pojave fundamentalno novih antigenskih varijanti virusa koje izazivaju velike epidemije i pandemije.Hemaglutinin je također receptor kojim se virus adsorbira na osjetljivim stanicama. , uključujući eritrocite, uzrokujući njihovo sljepljivanje, i uključen je u hemolizu eritrocita.Virusna neuraminidaza je enzim koji katalizira cijepanje sijalične kiseline iz supstrata. Ima antigena svojstva i istovremeno učestvuje u oslobađanju viriona iz ćelije domaćina. Neuraminidaza se, kao i hemaglutinin, mijenja kao rezultat antigenskog drifta i pomaka.Uzgoj i reprodukcija
Virusi gripa se uzgajaju u pilećim embrionima i u ćelijskim kulturama. Optimalno okruženje su pileći embrioni u čijim se amnionskim i alantoičnim šupljinama virus razmnožava 36-48 sati.Najosetljivije na virus gripa su primarne kulture ćelija bubrega ljudskog embrija i nekih životinja. Reprodukcija virusa u ovim kulturama je praćena blagim CPP, koji nalikuje spontanoj degeneraciji ćelija. Virusi gripa se adsorbiraju na glikoproteinskim receptorima epitelnih stanica, u koje prodiru endocitozom receptora. Transkripcija i replikacija virusnog genoma odvija se u ćelijskom jezgru. U ovom slučaju, pročitani pojedinačni fragmenti RNK u obliku mRNA se prevode u ribozome, gdje se sintetiziraju proteini specifični za virus. Nakon replikacije virusnog genoma formira se pul virusne RNK koji se koristi u sklapanju novih nukleokapsida.Patogeneza
Primarna reprodukcija virusa odvija se u epitelnim stanicama respiratornog trakta. Kroz erodiranu površinu sluznice virus ulazi u krvotok, uzrokujući viremiju. Cirkulacija virusa u krvi je praćena oštećenjem endotelnih stanica krvnih kapilara, što rezultira povećanjem njihove propusnosti. U teškim slučajevima uočavaju se krvarenja u plućima, srčanom mišiću i drugim unutrašnjim organima. Virusi gripe, ulazeći u limfne čvorove, oštećuju limfocite, što rezultira stečenom imunodeficijencijom, što doprinosi nastanku sekundarnih bakterijskih infekcija. Gripa izaziva intoksikaciju organizma različite težine.Imunitet
Mehanizam imunosti protiv gripa povezan je sa prirodnim faktorima antivirusne nespecifične zaštite, uglavnom sa proizvodnjom interferona i prirodnih ćelija ubica.Specifičan imunitet obezbeđuju ćelijski i humoralni faktori odgovora. Prve predstavljaju makrofagi i T-ubice. Potonji su imunoglobulini, prvenstveno antihemaglutinini i antineurominidazna antitijela, koja imaju svojstva neutralizacije virusa. Potonji, za razliku od antihemaglutinina, samo djelomično neutraliziraju virus gripe, sprječavajući njegovo širenje. Antitijela koja fiksiraju komplement na virusni nukleoprotein nemaju zaštitna svojstva i nakon 1,5 mjeseca. nestaju iz krvi rekonvalescenata.Antitela se nalaze u krvnom serumu 3-4 dana od početka bolesti i dostižu maksimalni titar nakon 2-3 nedelje. Trajanje specifičnog imuniteta stečenog nakon infekcije gripom, suprotno dosadašnjim idejama, mjeri se u nekoliko decenija. Do ovog zaključka došlo se na osnovu istraživanja starosne strukture incidencije gripe uzrokovane virusom A (H1N1) 1977. godine. Utvrđeno je da je ovaj virus, koji je bio odsutan od 1957. godine, 1977. oboljevao samo osobe mlađe od 20 godina. Dakle, nakon preležane infekcije gripom uzrokovane virusom gripe tipa A, formira se intenzivan imunitet, striktno specifičan za podtip virusa (po H- i N-antigenima) koji je izazvao njegovo stvaranje. Osim toga, novorođenčad imaju pasivni imunitet zbog antitijela klase IgG na odgovarajući podtip virusa A. Imunitet traje 6-8 mjeseci.Epidemiologija
Izvor infekcije su bolesni ljudi i nosioci virusa. Prijenos patogena odvija se kapljicama u zraku. Gripa se odnosi na epidemijske infekcije koje se često javljaju u zimskim i zimsko-proljetnim mjesecima. Otprilike svakih deset godina, epidemije gripa poprimaju oblik pandemije, koje pokrivaju stanovništvo različitih kontinenata. To je zbog promjene u H- i N-antigenima virusa tipa A povezane s antigenskim driftom i pomakom. Na primjer, virus gripa A sa hemaglutininom NSW1 izazvao je pandemiju španske gripe 1918. godine, koja je odnijela 20 miliona ljudskih života. Godine 1957. virus "azijske" gripe (H2N2) izazvao je pandemiju koja je zahvatila više od 2 milijarde ljudi. Godine 1968. pojavila se nova pandemijska varijanta, virus influence A (H3N2), nazvan "Hong Kong virus", koji cirkulira do danas. Godine 1977. pridružio joj se virus tipa A (H1N1), što je bilo neočekivano, budući da je identičan virus već cirkulirao 1947-1957, a potom je u potpunosti zamijenjen "azijskim" podtipom. S tim u vezi, pojavila se hipoteza da promjenjive varijante virusa nisu povijesno nove. Radi se o serosubtipovima koji cirkulišu proteklih godina.Prestanak cirkulacije virusa gripa koji je izazvao još jednu epidemiju objašnjava se kolektivnim imunitetom populacije koji se razvio na ovu antigenu varijantu patogena. U tom kontekstu dolazi do selekcije novih antigenskih varijanti na koje još nije formiran kolektivni imunitet.Još nije jasno gdje se pomjeraju antigenske varijante (seropodtipovi) virusa influence tipa A koji su napustili aktivnu cirkulaciju u određenom istorijskom periodu. čuvaju se dugo vremena. Moguće je da su rezervoar ovakvih virusa divlje i domaće životinje, posebno ptice, koje su zaražene ljudskim varijantama virusa gripe A i dugo ih održavaju u cirkulaciji. Istovremeno se u organizmu ptica dešavaju genetske rekombinacije između ptičjih i ljudskih virusa koje dovode do stvaranja novih antigenskih varijanti.Prema drugoj hipotezi, virusi gripe svih poznatih podtipova konstantno kruže među populacijom, ali postaju epidemiološki relevantni. samo sa smanjenjem kolektivnog imuniteta.Virusi gripa tipova B i C imaju veću antigensku stabilnost. Virusi gripe tipa B uzrokuju manje intenzivne epidemije i lokalizirane epidemije. Uzročnik sporadičnih bolesti je virus gripa tipa C. Virus gripa se brzo uništava temperaturama iznad 56°C, UV zračenjem, dezinfekcionim sredstvima, deterdžentima. Zadržava svoju održivost 1 dan. na sobnoj temperaturi, na glatkim metalnim i plastičnim površinama - do 2 dana. Virusi gripa preživljavaju na niskim temperaturama (-70°C).Specifična profilaksa
Za prevenciju gripa koristi se rimantadin koji suzbija reprodukciju virusa gripa tipa A. Za pasivnu profilaksu koristi se humani antiinfluenca imunoglobulin dobijen iz krvnog seruma davalaca imuniziranih vakcinom protiv gripe. Određeni efekat ima humani leukocitni interferon.Za vakcinaciju se koriste žive i inaktivirane vakcine. Uvođenjem živih vakcina formira se opći i lokalni imunitet. Osim toga, primjećuje se indukcija interferona.Trenutno su dobijene inaktivirane vakcine različitih tipova: virion, podjedinica, podijeljena i miješana. Virion vakcine se dobijaju visokokvalitetnim pročišćavanjem virusa uzgojenih u pilećim embrionima. Podjedinične vakcine su pročišćeni površinski antigeni virusa gripa - hemaglutinini i neuraminidaza. Ovakve vakcinalne preparate karakteriše niska reaktogenost i visoka imunogenost. Pocijepane ili dezintegrirane vakcine se dobivaju iz pročišćene suspenzije viriona tretiranjem deterdžentima. Međutim, još uvijek ne postoji konsenzus o prednostima bilo koje od ovih vakcina. Inaktivirane vakcine indukuju imuni odgovor u sistemu opšteg i lokalnog humoralnog imuniteta, ali u manjoj meri od živih vakcina indukuju sintezu interferona.Dugogodišnje iskustvo u primeni živih i inaktiviranih vakcina ukazuje na antigensku nepodudarnost sojeva vakcine. kod epidemijskih sojeva je glavni, ali ne i jedini razlog niske efikasnosti vakcinacije protiv gripa. Poslednjih godina se pokušavaju stvoriti genetski modifikovane i sintetičke vakcine protiv gripa.Gripa
Gripa je akutna respiratorna bolest ljudi koja se širi epidemijski. Karakterizira ga kataralna upala gornjih dišnih puteva, groznica, teška opća intoksikacija. Gripa je često praćena pojavom teških komplikacija - sekundarne bakterijske upale pluća, egzacerbacije hroničnih plućnih bolesti.Patogeni gripa pripadaju porodici Orthomyxoviridae. Uključuje tri roda virusa - A, B, C. Virus gripa ima sferni oblik, njegove dimenzije su 80-120 nm. Ponekad se formiraju filamentozni virioni. Genom je formiran od jednolančanog negativnog lanca RNK, koji se sastoji od osam fragmenata, a okružen je proteinskim kapsidom. RNK povezana sa 4 interna proteina: nukleoproteinima (NP) i proteinima visoke molekularne težine PI, P2, P3 koji su uključeni u transkripciju genoma i replikaciju virusa. Nukleokapsid ima spiralnu simetriju. Iznad kapsidne membrane nalazi se sloj matriksnog proteina (M protein). Na vanjskoj, superkapsidnoj membrani, hemaglutinin (H) i neuraminidaza (N) nalaze se u obliku bodlji. Oba glikoproteina (N i H) imaju izražena antigena svojstva. Kod virusa gripe pronađeno je 13 različitih antigenskih tipova hemaglutinina (NI-13) i 10 varijanti neuraminidaze (N1-10).Prema unutrašnjem nukleoproteinskom antigenu razlikuju se tri tipa virusa gripe - A, B, C, koji može se utvrditi u RSK. Virusi tipa A koji inficiraju ljude imaju tri tipa hemaglutinina (HI, H2, H3) i dva tipa neuraminidaze (N1, N2). U zavisnosti od njihove kombinacije, postoje varijante virusa gripa A - H1N1, H2N2, H3N2. određuju se u reakciji inhibicije hemaglutinacije sa odgovarajućim serumima Virusi gripa se lako uzgajaju u pilećim embrionima i raznim ćelijskim kulturama. Maksimalna akumulacija virusa se javlja nakon 2-3 dana. U vanjskom okruženju, virus brzo gubi svoju infektivnost sušenjem. Na niskoj temperaturi u frižideru se čuva nedelju dana, na -70°C - mnogo duže. Zagrijavanje dovodi do njegovog deaktiviranja nakon nekoliko minuta. Pod uticajem etra, fenola, formalin brzo kolabira.Virološka dijagnostička metoda
Kao materijal za istraživanje korišteni su nazofaringealni brisevi, iscjedak iz nosa uzet suhim ili mokrim sterilnim vatama u prvim danima bolesti, sputum. Virusi se mogu naći u krvi, cerebrospinalnoj tečnosti. U smrtonosnim slučajevima uzimaju se komadići zahvaćenih tkiva gornjih i donjih disajnih puteva, mozga i dr. Brisevi nazofarinksa se uzimaju na prazan želudac. Bolesnik treba tri puta isprati grlo sterilnom fiziološkom otopinom natrijum hlorida (10-15 ml), koja se skuplja u sterilnu teglu sa širokim grlom. Nakon toga se komadom sterilne vate obriše zadnji zid ždrijela, nosni prolazi, zatim se uroni u teglu sa ispiranjem.Materijal možete uzeti sterilnim štapićem navlaženim u rastvoru natrijum hlorida, koji se pažljivo obrisan zadnjim zidom grla. Nakon uzimanja materijala, bris se uranja u epruvetu sa fiziološkom otopinom u koju se dodaje 5% inaktiviranog životinjskog seruma. U laboratoriji, brisevi se ispiru u tečnosti, stisnu uz zid epruvete i vade. Dren se čuva u frižideru da se slegne, a zatim se srednji deo tečnosti unosi u sterilne epruvete. Antibiotici penicilin (200-1000 IU/ml), streptomicin (200-500 μg/ml), nistatin (100-1000 IU/ml) se dodaju u materijal za uništavanje povezane mikroflore, inkubiraju 30 minuta na sobnoj temperaturi i koriste da izoluje viruse, prethodno proverivši sterilnost.Osetljiva metoda za izolovanje virusa koji inficiraju kokošije embrione stare 10-11 dana. Materijal u zapremini od 0,1-0,2 ml ubrizgava se u amnionsku ili alantoisnu šupljinu. Inficirati, u pravilu, 3-5 embriona. Embrioni se inkubiraju na optimalnoj temperaturi od 33-34°C 72 sata. Kako bi se povećao broj viriona u ispitivanom materijalu, on je prethodno koncentriran. Da biste to učinili, koristite metode adsorpcije virusa na pilećim eritrocitima, tretman s 0,2% otopinom tripsina za poboljšanje infektivnih svojstava virusa ili ih precipitirajte posebnim metodama.Nakon inkubacije, pileći embriji se hlade na temperaturi od 4° C 2-4 sata, a zatim se usisava sterilnom pipetom ili štrcaljkom alantoisnu ili amnionsku tečnost. Pri tome se uz pomoć RHA utvrđuje prisustvo infektivnog virusa. Da biste to učinili, pomiješajte jednake količine (0,2 ml) virusnog materijala i 1% suspenzije pilećih eritrocita. Pozitivna reakcija (prisustvo virusa u materijalu) se dokazuje taloženjem eritrocita u obliku kišobrana.Ako se u materijalu nalazi virus koji ima svojstva hemaglutinacije, titrira se ekspandiranim RGA, pri čemu se određuje titar hemaglutinacijske aktivnosti. Uz pomoć ove reakcije određuje se titar virusa hemaglutinacije - najveće razrjeđenje materijala, koje još uvijek daje reakciju hemaglutinacije. Ova količina virusa uzima se kao jedna hemaglutinacijska jedinica (HAU).Identifikacija virusa gripe pomoću RTGA
Da biste to učinili, prvo pripremite radno razrjeđenje virusnog materijala, koji sadrži 4 GAO virusa u određenoj zapremini.Obračun reakcije se vrši nakon formiranja sedimenta eritrocita u kontrolnim jažicama. Pozitivna reakcija se dokazuje kašnjenjem hemaglutinacije u ispitnim jažicama.Virusi gripa se mogu izolovati korišćenjem različitih linija ćelijske kulture - ljudski embrion, majmunski bubreg, kontinuirana ćelijska linija bubrega psa (MDCK) i druge. U ćelijskim kulturama manifestuje se citopatsko dejstvo virusa (pojava ćelija sa zarubljenim ivicama, vakuola, stvaranje intranuklearnih i citoplazmatskih inkluzija), što se završava degeneracijom ćelijskog monosloja. 1:8). Osim ove reakcije, mogu se koristiti i RGGads, međutim, manje su osjetljivi i zahtijevaju titar imunološkog seruma od najmanje 1:160, kao i RSK, RN, PEMA itd.Serološka studija
Za potvrdu dijagnoze gripe koristi se serološki test. Bazira se na utvrđivanju četvorostrukog povećanja titra antitela u serumu bolesnika.Prvi serum se dobija na početku bolesti u akutnom periodu (2-5-1 dan bolesti), drugi - posle 10-14. dan bolesti. Pošto se serumi mogu konzumirati istovremeno, prvi od njih se čuva u frižideru na temperaturi od -20°C. Najčešće se koriste RTGA, RSK, RNGA. Ove reakcije se postavljaju posebnim setovima standardnih virusnih dijagnostičkih kompleta (referentni sojevi virusa gripe različitih seroloških tipova). Budući da serumi pacijenata mogu sadržavati nespecifične inhibitore hemaglutinacije, oni se prvo zagrijavaju na temperaturi od 56 °C, a također se tretiraju posebnim enzimom (na primjer, neuraminidazom) ili rastvorima kalijum perjodata, rivanola, mangan hlorida, vješanje bijelih guma itd. prema posebnim šemama. IReakcija inhibicije hemaglutinacije
Reakcija inhibicije hemaglutinacije može se staviti u epruvete (makroštod) ili u posebne ploče za imunološke studije.Reakcija se smatra pozitivnom kada se formira kompaktan, gusti sediment eritrocita sa glatkim ivicama.Express Diagnostics
Metoda se zasniva na detekciji specifičnih virusnih antigena u test materijalu uz pomoć imunofluorescencije u direktnom ili indirektnom RIF-u. Sluz se dobija iz nosnih prolaza ili stražnjeg zida ždrijela, centrifugira, a od taloga stanica cilindričnog epitela sluzokože na stakalcima se pripremaju brisevi. tretiraju se imunofluorescentnim serumima konjugiranim na fluorohrome, kao što je FITC (fluorescein izotiocijanat). Prilikom ispitivanja preparata pomoću luminiscentnog mikroskopa uočava se karakterističan zeleno-žuti sjaj virusa gripe, koji se na početku bolesti lokaliziraju u jezgri epitelnih stanica.U posljednje vrijeme se predlaže primjena ELISA, RZNGA i PCR da ukaže na specifične virusne antigene.Epidemijska sezona 2017-2018 je na putu. Vakcinatori pripremaju špriceve, terapeuti spremaju fonendoskope, farmaceuti zalihe "lijekova protiv gripe", a stanovništvo čita medijske izvještaje i nada se da će preživjeti još jedan sezonski virusni napad uz minimalne gubitke. Tokom godina aktivnog razvoja informacionog prostora građani su se već navikli na misteriozne nazive H1N1 ili H5N1, a neki već znaju da je prvi svinjski, a drugi ptičji grip. Ali do sada, malo običnih pacijenata - bivših i budućih - razumije kako virus gripe djeluje i kako točno djeluje. MedAboutMe će popuniti ovu prazninu.
Kako je organizovan virus gripa?
Virusi gripa pripadaju posebnoj porodici ortomiksovirusa. Njihov genom ne sadrži dvolančanu DNK, kao kod ljudi, već jednolančanu RNK. Štaviše, ovaj lanac se sastoji od 8 zasebnih fragmenata koji kodiraju općenito samo 11 proteina. Fragmenti RNK se čak i repliciraju, odnosno umnožavaju nezavisno jedan od drugog. Ovo je važna tačka koja objašnjava zašto se virusi gripe tako lako mijenjaju i formiraju nove varijante. Ako su dva različita soja virusa gripe prodrla u jednu ćeliju, tada mogu zamijeniti odvojene dijelove genoma, stvarajući tako nove, ranije nepostojeće reasortantne viruse.
Oblik virusa je sfera. U samom srcu ove sfere nalaze se fragmenti RNA lanca, od kojih je svaki povezan sa skupom proteina odgovornih za replikaciju ovog određenog fragmenta genoma, odnosno predstavljaju 8 nukleoproteina. Svi ovi nukleoproteini su upakovani u nukleokapsid, delikatno uvrnutu proteinsku ljusku. A na vrhu - a to je posebna karakteristika takozvanih virusa s omotačem - postoji još jedan premaz, koji se zove superkapsid.
Superkapsid je izuzetno važna formacija za virus gripe. Zapravo, ovo je lipidna dvoslojna membrana, koja uključuje nekoliko vrsta glikoproteina - kompleksa proteina i ugljikohidrata. Na osnovu glikoproteina naučnici određuju kakav je soj virusa gripa ušao u njihovu epruvetu. Zahvaljujući ovim spojevima virus ulazi u ćeliju i razmnožava se. I, konačno, neki efikasni lijekovi protiv gripe usmjereni su na kontakt s glikoproteinima.
Koja se jedinstvena jedinjenja mogu naći na površini superkapsida virusa gripa?
- Hemaglutinin.
Ovo je spoj s kojim virus, prvo, prepoznaje receptore ćelija organizma domaćina, a drugo, vezuje se za njih. Antitijela na hemaglutinin nastaju kada se osoba razboli od određenog soja virusa gripe i pruža zaštitu od njega u budućnosti. Postoji 16 podtipova hemaglutinina.
- Neuraminidaza.
Ovo je enzim koji, prvo, uništava komponente zaštitnog sloja sluzi na sluznicama respiratornog trakta i na taj način olakšava prolaz virusa do ciljne stanice. Drugo, neuraminidaza je uključena u fuziju virusne čestice sa ćelijom. Konačno, osigurava oslobađanje novih virusnih čestica iz inficirane ćelije. Da nema neuraminidaze, tada bi ciklus reprodukcije bio ograničen na samo jednu ćeliju, čak i bez ikakvih simptoma bolesti. Antitijela na neuraminidazu nastaju u našem tijelu kao rezultat vakcinacije – ne dozvoljavaju virusu gripa da se širi po cijelom tijelu. Postoji 9 podtipova neuraminidaze u virusima influence A i po jedan u virusima gripe B i C.
- M2 protein.
Ovo je takozvani jonski kanal, odnosno podesiva „rupa“ u membrani virusa kroz koju se ioni mogu kretati. Pošto govorimo o ionima, to znači da govorimo o naelektrisanju koje oni nose, odnosno kada radi jonski kanal, pH unutar virusne čestice će se promeniti. M2-protein je namijenjen za prijenos protona, odnosno jezgara atoma vodika koja imaju pozitivan naboj (H+).
Dakle, virus gripa se uz pomoć neuraminidaze probio kroz sloj sluzi u respiratornom traktu i stigao do površine epitelne ćelije, tačnije do trepljavog epitela koji ih oblaže. Neuraminidaza ima poseban "džep" kojim se vezuje za male ostatke ugljikohidrata koji strše iz ćelijske membrane (oligosaharide). U tom slučaju, superkapsid virusa dolazi u kontakt sa staničnom membranom i njihovi lipidni slojevi se spajaju. Kao rezultat toga, nukleokapsid, koji sadrži, kako se sjećamo, 8 segmenata RNK, ulazi u ćeliju, u njenu citoplazmu.
Dok je u toku proces prodiranja nukleokapsida virusa u ćeliju, protein M2 aktivno radi. On pumpa protone u virus, što znači da okruženje unutar njega postaje sve kiselije. Kao rezultat ovih manipulacija, sadržaj nukleokapsida prodire u ćelijsko jezgro. Istovremeno se oslobađaju segmenti virusne RNK u obliku kompleksa sa proteinima koji primaju na raspolaganje sve potrebne resurse ćelije i započinju proizvodnju novih virusa. Ovo je također vrlo promišljen proces, tokom kojeg se formiraju "privremene" mRNA, ostavljajući jezgro citoplazmi da tamo organizira sintezu virusnih proteina. Zatim se ovi proteini transportuju u jezgro, gdje se, konačno, odvija sastavljanje virusnih čestica. Dio nove genomske RNK koristi se za dodatnu replikaciju genoma virusa.
Može se samo diviti preciznosti sklapanja 8 različitih segmenata virusne RNK u jednu buduću virusnu česticu. Nemoguće je da dva identična segmenta uđu u isti nukleokapsid, a mehanizam ovog procesa je još uvijek nepoznat. U ovom trenutku samo može doći do stvaranja reasortantnih virusa, o čemu smo gore govorili. Konačno, gotovi nukleokapsidi se kreću u citoplazmu. Prilikom prolaska kroz ćelijsku membranu, svježe sastavljeni nukleokapsid dobiva superkapsidnu ljusku s cijelim setom glikoproteina.
Cijeli ciklus od prodiranja virusa u ćeliju do oslobađanja novih virusnih čestica iz nje traje od 6 do 8 sati. Brojni virusi izlaze i inficiraju susjedne ćelije. Rijeđe, virioni ulaze u krvotok i šire se po cijelom tijelu. Širenje virusa kroz tkiva i organe naziva se viremija. Vrhunac umnožavanja virusa gripe bilježi se u intervalu od 24 do 72 sata od trenutka kada virusne čestice uđu u epitel respiratornog trakta.
Kada se oslobode novi virioni, stanice u kojima su se razmnožile umiru. Izbija upalni proces. Dakle, kod gripe su prvenstveno zahvaćeni gornji respiratorni trakt, postepeno upala zahvata dušnik i bronhije. Ako virusi uđu u krvotok i šire se po cijelom tijelu, infekcija postaje generalizirana, razvija se intoksikacija tijela.
Opasnost od gripa leži u činjenici da pogađa krvne sudove i nervni sistem. U pozadini infekcije virusom gripe dolazi do masovnog stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), odnosno slobodnih radikala koji imaju tendenciju oksidacije svega što im se nađe na putu.
Treba imati na umu da sam virus gripe ne sadrži toksine. Toksičan učinak imaju spojevi koje naše tijelo proizvodi u pokušaju da se zaštiti od virusa. Ova reakcija je toliko burna, a mjesto za unošenje virusa je odabrano tako „uspješno“ da čovjek pati od vlastitog imunološkog sistema. Prema istraživanjima, ROS pokreću procese proteolize - uništavanja proteina. Ovo se dešava u disajnim putevima na granici sa vazduhom, što rezultira "respiratornim" ili "metaboličkim" eksplozijom.
Budući da se proces unošenja i razmnožavanja virusa odvija u respiratornom traktu, prije svega stradaju zidovi kapilara koji se tamo nalaze (male krvne žile). Postaju krhkiji, propusniji, što u težim slučajevima dovodi do poremećaja lokalne cirkulacije, razvoja hemoragičnog sindroma i opasnosti od plućnog edema. U pozadini oštećenja krvožilnog sustava, dotok krvi u mozak može se pogoršati i kao rezultat toga nastaje neurotoksični sindrom.
Imuni sistem u ovom trenutku aktivira proizvodnju ogromne količine citokina - tvari koje pokreću upalne reakcije i imaju citotoksični učinak. Obično bi se trebali baviti inaktivacijom i eliminacijom infektivnih agenasa. Ali obim procesa je toliko velik da se razvija sistemska upalna reakcija.
Kao rezultat toga, zbog oštećenja sluznice respiratornog trakta i krvnih žila, smanjuje se sposobnost imunološkog sustava da izdrži vanjske prijetnje, a smanjuje se aktivnost zaštitnih krvnih stanica neutrofila. Općenito, to dovodi do aktivacije postojećih kroničnih bolesti i povećava rizik od bakterijske infekcije. Najteža i najčešća komplikacija gripe je upala pluća.
Različiti sojevi gripe razlikuju se jedni od drugih, posebno po sposobnosti da aktiviraju masovnu proizvodnju ROS. Stoga su neke vrste gripe teže, dok su druge lakše. U velikoj mjeri ulogu igra stanje tijela pacijenta, njegov imunološki status, iskustvo poznanstva sa drugim sojevima. Neki tipovi gripa su opasniji za starije i djecu, dok drugi češće pogađaju populaciju u najboljim godinama.
Da bi se zaustavio proces umnožavanja virusa u ćelijama i njegovog širenja po cijelom tijelu, potrebne su tvari koje mogu prekinuti njegov ciklus reprodukcije, usavršen evolucijom.
1961. godine naučnici su predložili borbu protiv virusa gripa amantadinom. Ovo jedinjenje je odobreno za upotrebu 1966. godine, a 1993. godine pojavio se rimantadin, njegov analog. Amantadin (i rimantadin) su u stanju da blokiraju jonske kanale M2 proteina. Ovo zaustavlja replikaciju virusa u početnim fazama.
Lijek je bio vrlo efikasan protiv virusa grupe A, ali nije djelovao na viruse grupe B i C. A 2006. godine američki Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) objavili su podatke o izuzetno visokoj rezistenciji (otpornosti) nekih sojeva virusa. do adamantana, dostižući i do 90%. Uzrok su bile tačkaste mutacije u genomu virusa koje su se javile tokom liječenja adamantanima. Dakle, danas se rimantadin i njegovi drugi analozi smatraju neefikasnim lijekovima. Štaviše, u početku su bili beskorisni protiv virusa grupa B i C.
Godine 1983. razvijeni su inhibitori neuraminidaze - supstance koje blokiraju sposobnost enzima da započne proces napuštanja novih viriona iz inficirane ćelije. Ovo vam omogućava da zaustavite replikaciju i širenje virusa.
Inhibitori neuraminidaze uključuju oseltamivir (Tamiflu) i zanamivir (Relenza). Od 2009. još jedan intravenski lijek iz ove grupe, paramivir, odobren je za upotrebu u Sjedinjenim Državama. Ovi lijekovi su, zapravo, jedini lijekovi dizajnirani posebno za borbu protiv virusa gripe. Ali treba ih uzeti u roku od 24-48 sati od trenutka prvih manifestacija bolesti. Kasnije će biti neučinkoviti - brojni novi virusi će se već proširiti po cijelom tijelu.
Sva druga takozvana antivirusna sredstva nemaju nikakvog utjecaja na sam virus gripe niti na pojedine faze njegovog prodora u organizam, razmnožavanja i širenja.
- Virus gripe je konstrukt koji je priroda osmislila da prodre u tijelo kroz respiratorni trakt i opremljen svim potrebnim "glavnim ključevima" za to.
- Postoji samo nekoliko vrsta lijekova koji djeluju specifično na virus gripe, uzimajući u obzir karakteristike njegovog životnog ciklusa i strukture. Ali jedan od ovih lijekova je već nedjelotvoran, jer se virus na njega prilagodio. A druge vrste lijekova djelotvorne su samo vrlo kratko nakon pojave prvih simptoma. Efekat drugih lijekova protiv gripe nije dokazan.
- Stoga se za liječenje gripe koristi simptomatska terapija i praćenje stanja pacijenta. U većini slučajeva kod gripe je dovoljno samo ležati kod kuće, uzimati lijekove za snižavanje visoke temperature ako je narasla na 39°C i druga sredstva za ublažavanje stanja pacijenta. Važno je spriječiti razvoj komplikacija - za to samo trebate stvoriti sve uvjete da se tijelo bori protiv virusa.
- Vakcinacija je i dalje najbolji način borbe protiv virusa. Čak i ako je osoba vakcinisana protiv jednog soja, a zaražena drugom, postojeća antitijela mogu pružiti barem minimalnu zaštitu i olakšati tok bolesti.
Preuzmite aplikaciju za gripu i vakcinaciju
K. SCHOLTISSEK i H.-D. KLENK (CH. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK)
I. UVOD
Postoji niz recenzija o problemu replikacije virusa gripe. Literatura prije 1968. sažeta je u Hoyle (1968) i Scholtissek (1969); noviji pregledi su White (1973) i Compans i Choppin (1974).
Većina podataka o replikaciji dobijena je proučavanjem virusa influence tipa A. Značajne razlike u (Mehanizmi replikacije drugih tipova virusa gripe još nisu pronađeni.
Nekoliko sistema ćelijske kulture pogodnih za proučavanje replikacije postalo je popularno, kao što je razmnožavanje WSN soja virusa influence u MDBK ćelijama (Choppin, 1969) ili razmnožavanje virusa ptičje kuge (FPV) u ćelijama fibroblasta embriona pilića. Primjer krivulje rasta posljednjeg virusa u jednom ciklusu je dokazan na 30, gdje je period latencije otprilike 3 sata, a proizvodnja virusa dostiže plato između 8 i 12 sati infekcije. Stoga su takvi sistemi veoma pogodni za biohemijske studije.
II. ADSORPCIJA, PENETRACIJA, "STRIPING" VIRUSA
Infekcija ćelije virusom počinje adsorpcijom, odnosno vezivanjem virusne čestice na površinu ćelije. Za vezivanje su potrebne dvije komplementarne strukture, a to su: receptorska mjesta na "površini ćelije i virusna komponenta odgovorna za prepoznavanje ovih receptorskih mjesta. Dugi niz godina je sposobnost virusa gripe da stupi u interakciju s eritrocitima različitog porijekla i da ih aglutinira poznato (Hirst, 1941; McClelland, Hare, 1941) Hemaglutinacija je korištena kao model odgovora za interakciju virusa gripa sa površinom ćelije, i "većina vašeg znanja o ovom fenomenu dolazi iz takvih studija. Međutim, treba biti veoma oprezan u generalizacijama, jer strukture površine eritrocita i površine inficiranih ćelija mogu biti potpuno različite (vidi i Poglavlje 3).
A. ULOGA HEMAGGLUTININA U ADSORPCIJI
Komponenta viriona uključena u vezivanje je HA* šiljak. Uloga virusnih β-proteina u inicijaciji infekcije proučavana je korištenjem antitijela specifičnih za dva površinska proteina: HA* i NA*. Ova antitijela se mogu dobiti pomoću rekombinantnih virusa. Na primjer, ukrštanje između AO i A2 virusa rezultira formiranjem rekombinantnog X7F1, koji nosi HA*, AO i NA* A2 (Kilbourne et al., 1968). Antiserum protiv virusa X7F1 ne inhibira NA* virusa gripe tipa AO, ali inhibira hemaglutinaciju i neutralizira infektivnost ovog tipa virusa. Interakcija istog seruma sa A2 virusima influence ne inhibira hemaglutinaciju ili infektivnost, iako je neutralizacija aktivnosti NA* potpuna. Dakle, NA* nije uključen u proces iniciranja infekcije, a čini se da je samo NA* odgovoran za adsorpciju. Ovaj koncept je podržan dokazima da su virusne čestice iz kojih su proteolitičkim enzimima uklonjene samo šiljci neuraminidaze ostale infektivne (Schulze, 1970).
Postoje dokazi da je hemaglutinirajući dio lokaliziran na vanjskom dijelu "šiljaka" HA*, bogatog ugljikohidratima (vidi Poglavlje 3). Čini se da su ugljikohidrati neophodni za funkcionisanje HA*, budući da neglikozilirani HA* proteini nisu u stanju da se vežu za eritrocite (Klenk et al., 1972b).
B. RECEPTOR VIRUSA INFLUENCE
Ugljikohidrati su esencijalni (komponenta ne samo hemaglutišina, već i virusnog receptora na površini ćelije. Hirst (1942) je uočio da je kompleks virus-eritrocit nestabilan i da je receptor na površini ćelije uništen enzimom Kao što je kasnije pokazano, ovaj enzim je neuraminidaza, koja cijepa neurašinsku kiselinu od glikoproteina (Klenk et al., 1955; Klenk, Stoffel, 1956; Gottschalk, 1957). Ovo je bila prva demonstracija enzima koji je sastavni dio virusne čestice, 1947. Tako je otkriveno da je receptor za virus gripe glikoprotein koji sadrži neuraminsku kiselinu.
Od tada se nakupilo mnogo informacija
o receptoru miksovirusa, sažeto nedavno u pregledu
Hughes (1973). Ukratko, dobijeni podaci se svode na sljedeće
puše. Receptorna mjesta sadrže ostatke neuromio-
joične kiseline, koje su prisutne u lancima ugljikohidrata
glikoproteini. Neoksidirajući terminalni ostaci neurama
noznla su neophodne za interakciju glikoproteina sa vi
virusa gripa. Tretman neuraminidazom potpuno uklanja
obavezujuća aktivnost. Studije degradacije sa
korištenje periodat sugerira da za povezivanje
aktivnost zahtijeva netaknutu neuraminsku molekulu
kiseline (Suttajit i Winzler, 1971). karboksilna grupa,
verovatno takođe igra važnu ulogu, pošto je neophodno,
očigledno i elektrostatičke sile (Huang, 1974).
Čini se vjerovatnim da postoji samo slab specijal
karakteristika u odnosu na strukturu s kojom je povezan
neuraminsku kiselinu, budući da je, kako je pokazano, cjelina
set glikoproteina koji sadrži yairaminsku kiselinu,
povezane sa miksovirusima. Štaviše, gangliozidi (gli-
aktivni su u tom pogledu (Haywood, 1975).
Treba se nadati da će pitanje vezivanja virusa gripa postati jasnije kada se uspostavi molekularna struktura receptora. U određenoj mjeri, to je već postignuto u slučaju eritrocita (Marchesi et al., 1973). Dodatne informacije također se mogu pružiti proučavanjem vezanosti miksovirusa za umjetne membrane (Tiffany i Blough, 1971).
C. MOGUĆI MEHANIZMI PRODIRANJA I "TRAGANJA"
Predložena su dva različita "mehanizma za penetraciju i "uklanjanje" ne samo virusa gripe, već i virusa općenito. Oba gledišta su uglavnom zasnovana na studijama u elektronskom mikroskopu. Jedan od tih mehanizama je vironeksija, koja Vjeruje se da je to proces ppnocitoze kada su virusne čestice uključene u pinozome, koji se kasnije spajaju s lizosomima, a enzimi lizosoma uzrokuju da se virus "svuče" (Fazekas de St. Grot, 1948.) Elektronsko mikroskopska potvrda ove tačke Pogled je dobijen u radovima Dalesa i Choppina (1962) i Dourmashkin i Tyrrell (1970). 10 minuta nakon infekcije, virusne čestice su viđene u direktnom kontaktu sa površinom ćelije, a 20 minuta čestice su nađene unutar citoplazmatskih vakuola. Za razliku od ove studije, Morgan i Rose (1968) sugeriraju da ulazak može biti posljedica fuzije virusne ovojnice sa membranom ćelije domaćina. Dakle, trenutno ne postoji konsenzus o mehanizmu prodiranja virusa gripa.
Kako je opisano u pogl. 5, virioni virusa gripe sadrže RNA polimerazu povezanu sa njihovim ribonukleoproteinskim komponentama. Zbog toga je malo vjerovatno da je proces "svlačenja" prostorno odvojen od procesa oslobađanja ribonukleolroteina. A ova faza se odvija na površini ćelije, prema mehanizmu fuziju membrane, te u fagocitnim vezikulama, prema mehanizmu viroheksise.
III. TRANSKRIPCIJA A. SEKVENCIJA SINTEZE RNK
Nakon "svlačenja" sRNA viriona se mora transkribovati u komplementarnu RNK. RNK polimeraza uvedena sa inficirajućom česticom mora funkcionirati u prvoj fazi reprodukcije virusa (vidi Poglavlje 5). Genom virusa gripe može se izolovati iz viriona samo u obliku
pojedinačni fragmenti (vidi poglavlje 6). Štaviše, on funkcioniše u obliku - odvojenih fragmenata, što je pokazalo genetskom analizom (om. Ch. 7) i postupnom inaktivacijom infektivnog virusa (Scholtissek, Rott, 1964). U tom smislu treba pretpostaviti da - polimeraza inicira sintezu RNK u svakom pojedinačnom fragmentu. Pošto RNK ne postoji u ćeliji kao slobodna molekula, već je uvek obložena proteinom, postavlja se pitanje: sa kojim proteinom je virusna RNK povezana tokom svoje replikacije?
Eksperimenti provedeni na sintezi RNK virusa gripe predstavljaju velike poteškoće, budući da se aktinomicin D ne može koristiti za otkrivanje proizvodnje virusne RNK uz specifičnu inhibiciju sinteze ćelijske RNK, budući da ovaj antibiotik inhibira reprodukciju virusa influence (Barry et al., 1962.); Rott i Scholtissek, 1964; Barry et al., 1965; Pons, 1967). Iz tog razloga, da bi se odredio slijed sinteze RNK tokom vremena, korištena je specifična hibridizacija pulsno označene RNK u različitim točkama nakon infekcije sa viškom bilo neobeležene vRNA ili scRNA nakon čega je uslijedio tretman RNase (Scholtissek i Rott, 1970). U ranim fazama infektivnog ciklusa prevladavala je sinteza ecRNA koja je dostigla maksimum oko 2 sata nakon infekcije, dok je u kasnijim fazama većina proizvedene virusno specifične RNK bila vRNA. Krug (1972), koristeći drugačiju metodu, također je pokazao da 4 sata nakon infekcije, sinteza BIKPHK gotovo potpuno prestaje. Nakon ekstrakcije fenolom, nalazi se relativno mala količina lncRNA (Scholtissek i Rott, 1970).
Zbog činjenice da jedan ili drugi tip virusne RNK ima informaciju1!! funkcionira i koristi se kao šablon za sintezu virusnih proteina (vidi odjeljak IVA), može postojati određena kontrola translacije na nivou diferencijalnog katabolizma virusne RNK. Zbog toga su sprovedeni eksperimenti puls-chase za proučavanje stabilnosti RNK virusa influence in vivo. Za razliku od ćelijske RNK, otkriveno je da su oba tipa virusne RNK potpuno stabilna tokom 90-minutnog chenza perioda (Scholtissek et al., 1972).
Ranije, prilikom proučavanja sinteze virusne RNK in vivo, kada je aktinomicin D dodat u kasnim fazama infektivnog ciklusa (Duesberg i Robinson, 1967; Nayak, 1970; Ma-hy, 1970), nije uzeto u obzir da antibiotik specifično inhibira sintezu komplementarne RNK in vivo (Scholtissek i Rott, 1970; Pons, 1973). Budući da je lncRNA izolirana iz inficiranih stanica kao najmanje pet zasebnih fragmenata, zaključeno je da se virusna RNK također sintetizira kao fragmenti (Pons i Hirst, 1968).
B. LOKALIZACIJA SINTEZE VIRUSNE RNK UNUTAR ĆELIJE DOMAĆINA
Iz podataka dobijenih tokom autoradiografije, zaključeno je da su mjesto sinteze virusne RNK, po svemu sudeći, ćelijska jezgra (Scholtissek et al., 1962; Barry et al., 1974). Budući da su pulsni periodi korišteni u ovim studijama još uvijek bili predugi, ne može se isključiti da se virusna RNK sintetizira u citoplazmi ćelije i zatim transportuje do jezgara gdje se može akumulirati. Osim toga, vRNA i scRNA mogu se sintetizirati u ćeliji na različitim mjestima.
C. INHIBICIJA SINTEZE VIRUSNE RNK 1. Actimomycin D, Mithramycin i α-amanitin
Kada se aktinomicin D ili mitramicin, koji ometaju funkciju DNK šablona, dodaju inficiranim stanicama u vrijeme kada je virusna RNA zavisna RNA iopolimeraza već prisutna (na primjer, 2 sata nakon infekcije), vRNA nastavlja da se sintetizira oko 2 sata. produkcija scRNA, međutim, odmah prestaje. Kasnije se sinteza vRNA također smanjuje, što ukazuje da zahtijeva kontinuiranu proizvodnju scRNA (Rott et al., 1965; Scholtissek i Rott, 1970; Scholtissek et al., 1970; Pons, 1973). Gregoriades (1970) je pokazao da aktinomicin D takođe ima snažan efekat na sintezu vRNA kada se dodaje kasno u infektivnom ciklusu. U ovim eksperimentima, sinteza virusne RNK je određena povećanjem inkorporacije obilježenog uridina u ukupnu RNK inficiranih stanica. Ovo povećanje se može ukinuti dodatkom aktinomicina D. Međutim, treba imati na umu da infekcija virusom gripe uzrokuje povećanje inkorporacije obilježenog uridina u ćeliju nakon infekcije (Scholtissek et al., 1967) i da aktinomicin D ima inhibitorni efekat na ovu inkorporaciju (Scholtissek et al., 1969). siAmanitin, koji nema afinitet za DNK, utiče na aktivnost jedne od ćelijskih RNA polimeraza (RNA podimeraza II), takođe inhibira sintezu escRNA kada se doda u tečnost kulture odmah nakon infekcije (Rott i Scholtissek, 1970; Mahy et al. ., 1972).
Mehanizam po kojem ovi antibiotici specifično inhibiraju sintezu ssRNA nije u potpunosti shvaćen, jer ne ometaju stvaranje ssRNA in vitro. Dakle, ovi antibiotici djeluju samo in vivo, iako se enzim koji sintetiše ssRNA može izolirati iz stanica koje dosegnu nakon 2. h nakon infekcije, dodat je aktinomicin D (Scholtissek i Rott, 1969a).
Reprodukcija "virusa gripe može se potisnuti i drugim djelovanjem na DNK ćelije domaćina - uvođenjem mitomcina C, predtretman ultraljubičastim zračenjem ili uklanjanjem ćelijskih jezgara prije infekcije (Barry, 1964; Rott et al., 1965; Nayak , Rasmussen, 1966; Follett et al., 1974; Kelly et al., 1974). Mehanizam po kojem ovi efekti utiču na replikaciju virusa gripe može "biti isti kao i kod drugih antibiotika. Jedina sugestija" koja se može iznijeti iz ovih studija je da postoji potreba za "funkcionalno" aktivnim jezgrima ćelija i (ili) u DNK-ovisna funkcija ćelije za reprodukciju virusa gripe. Nemoguće je reći koje su to funkcije.
2. Cikloheksimid
Kada se doda cikloheksimid, koji specifično inhibira sintezu proteina u životinjskim ćelijama, 2 h nakon infekcije virusom gripe, formiranje vRNA odmah prestaje, dok se formiranje vzhRNA nastavlja još najmanje 2 h (Scholtissek i Rott, 1970; Pons, 1973). Još nije poznato da li je potrebna kontinuirana sinteza virusnog ili "ćelijskog" proteina koji se koristi kao "kvalitet/kofaktor za polimerazu koja sintetiše vRNA", ili je potreban neki "protein (na primjer, NP protein) za stabilizaciju novosintetizirana vRNA, ili suzbijanje sinteze određenog virusnog proteina dovodi do kontinuiranog stvaranja ecRNA, čija se sinteza normalno gasi 3 sata nakon infekcije. Ovo gašenje može biti neophodno da se pokrene sinteza vRNA. Studije s mutantima osjetljivim na temperaturu trebale bi odgovoriti na neka od ovih pitanja.
Eksperimenti Beana i Simpsona (1973) pokazali su da in vivo primarna transkripcija (sinteza ecRNA na mRNA šablonu pomoću polimeraze inficirajuće čestice) nije potisnuta cikloheksimidom, dok aktinomicin D potpuno potiskuje transkripciju. Dakle, cikloheksimid ne utiče in vivo na aktivnost polimeraze uvedene sa inficirajućom česticom i koja sintetiše ecRNA, ali inhibira sintezu nove polimeraze neophodne za proizvodnju ecRNA.
3. Glukozamin
Poznato je da glukozamin iscrpljuje UTP bazen u ćelijama pilećih embriona stvaranjem UTP-]M-acetilglukozamina (Scholtissek, 1971.). Kada se Earlov rastvor koji sadrži glukozu koristi kao medij za kulturu, on
utiče samo na sintezu virusnih glikoproteina (vidjeti dio V). Međutim, ako se glukoza kao izvor energije zamijeni liruvatom ili fukozom, tada se iscrpljivanje UTP bazena ovim amino šećerima događa otprilike 10 puta aktivnije. Pod ovim uslovima, UTP pul ćelije domaćina postaje specifičan limitator brzine sinteze vRNA, dok sinteza (ćelijske RNK) još nije pogođena (Scholtissek, 1975). Kao rezultat supresije sinteze virusne RNK , formiranje virusnih proteina također je odsutno.
Ovi podaci se mogu tumačiti na dva načina: ili virusna RNA zavisna RNA polimeraza ima nizak afinitet za UTP u poređenju sa ćelijskom DNK zavisnom "i RIC polimerazom, ili postoje dva manje ili više nezavisna skupa UTP u ćeliji, jedan od kojih se "može koristiti za sintezu virusne RNK i više je pod utjecajem glukozamina nego drugi bazen, koji se može koristiti kao supstrat RNA polimerazama.
D. SINTEZA VIRUSNE RNK IN VITRO
U ćelijama inficiranim virusom gripe, nekoliko istraživača je pronašlo RNA zavisnu RNA polimerazu (Ho, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970; Compans , Caliguiri, 1973). Većina aktivnosti enzima nalazi se u mikrosomskoj frakciji inficiranih stanica. U in vitro sistemu, ovu aktivnost uklanja RNaza, ali ne i DNaza. To znači da je interni šablon RNK.Reakcija zahtijeva prisustvo sva četiri nukleozid trifosfata i osjetljiva je na aktinom-icin D. Većina proizvodnje reakcije in vitro ima nisku relativnu molekulsku težinu. Podaci Horisbergera i Guskeya (1973) sugeriraju da su u citoplazmi prisutne dvije različite aktivnosti enzima: jedna je zavisna od Mg++ i inhibirana je relativno visokim koncentracijama soli, druga je zavisna od Mn++ i otpornija na soli. Posljednja aktivnost enzima također se nalazi unutar virusne čestice (vidi Poglavlje 5).
Dobiveni su suprotni rezultati u pogledu proizvoda citoplazmatskog enzima u in vitro sistemu. Ruck ■ et al. (1969) izvještavaju da u njihovim rukama ovaj enzim sintetiše barem "neke od RNA tipa virion (od 14 do 19S). Autori su do ovog zaključka došli prilikom određivanja baznog sastava proizvoda u in vitro sistemu nakon inkubacije mikrosomalna frakcija sa sva četiri označena nukleozid trifosfata poznate specifične radioaktivnosti.
adenilnoj kiselini suseda dobijenih u istom radu upotrebom [(a-32P]ATP) su u skladu sa podacima analize najbližeg suseda koje je dobio Scholtissek (1969), koji je zaključio da proizvod u in vitro sistemu ima strukturu escRNA Mahy i Bromley (1970) u svojoj originalnoj publikaciji su također izjavili da neki od proizvoda u in vitro sistemu koji proizvodi citoplazmatski enzim mora "biti esRNA. Međutim, nedavno su Hastie i Mahy (1973) u svojoj analizi najbližeg susjeda i Specifična hibridizacija potvrdila je proizvodnju gotovo isključivo scRNA od strane citoplazmatskog enzima, kao što je prvi pokazao Scholtissek (1969). manje od 90% od kojih ima baznu sekvencu komplementarnu svRNA. Hastie i Mahy (1973) "utvrdili su da značajan procenat proizvoda u sistemu ieme in vitro, sintetizovan nuklearnim enzimom u prisustvu aktinomicina D, nije bio u stanju da se hibridizuje sa neobeleženom vRNA Još nije jasno koji tip RNK nije sposoban za takvu hibridizaciju. Vrlo mali dio RNK sintetizirane pod ovim uvjetima hibridizira se s neobilježenom acRNA (Scholtissek, neobjavljeni podaci).
Kinetika inkorporacije obilježenog GTP-a u virusnu RNK može se protumačiti kao naznaka da nema ponovnog pokretanja sinteze RNK u in vitro sistemu. Ako se sirovi enzimski pripravak inkubira pri niskim koncentracijama soli, gotovo sva novosintetizirana RNK je u početku jednolančana. Međutim, nakon ekstrakcije fenolom, "veliki postotak RNK postaje otporan na RNAazu. Fenol pretvara srednju replikacijsku strukturu, koja se sastoji od jednolančane šablone i novosintetizirane scRNA koju molekula polimeraze drži zajedno na mjestu replikacije, u djelomično dvolančana struktura (Feix et al., 1967; Oberg i Philipson, 1971). Ovi podaci o produktu enzima virusa influence u in vitro sistemu mogu se protumačiti na način da polimeraza ne samo da pokreće i nastavlja polimerizaciju, već odvaja novosintetizirani lanac od svog šablona. Inače se formira dvolančana RNK struktura, koja nema "biološke funkcije" (Paffenholz, Scholtissek, 1973).
Korišteno je ovo svojstvo RNA polimeraze virusa gripe da sintetizira isključivo scRNA u in vitro sistemu
Pozvan da uspostavi genetski odnos različitih sojeva virusa gripe određivanjem homologije u baznoj sekvenci između njih (Scholtissek, Rott, 1969b; Hobson, Scholtissek, 1970; Anschutz et al., 1972).
IV. SINTEZA VIRUSNIH PROTEINA
A. IN VITRO PREVOD
Problem koji tip RNK - virionske ili komplementarne - je "informativan za sintezu virusnih proteina, još nije riješen. Dobiveni su kontradiktorni rezultati u pogledu tipa virusno specifične RNK povezane s polisomima. Nayak (1970. ) nalazi se u polisomalnom području gradijenta saharoze, uglavnom vRNA, dok je Pons (1972.) isključivo izolirao scRNA iz polizama. Ovo posljednje je potvrđeno zapažanjem da nakon dodavanja 2 sata nakon infekcije aktinomicin D, koji prvenstveno utiče na sintezu scRNA (vidi odjeljak III, B, 1), u polisomima inficiranih stanica, ecRNA nije otkrivena (Pons, 1973).
Koristeći "sistem za sintezu proteina iz E. coli i influenca vRNA kao šablonu, Siegert i saradnici (1973) su posmatrali proizvodnju virusnog NP proteina u uslovima in vitro. Ovaj označeni NP protein karakterisan je metodom precipitacije Ouchterlony gelom. Nasuprot tome, Kingsbury i Webster (1973) nisu primijetili nikakvu sintezu virusnih proteina iz vRNA koristeći sistem za sintezu proteina izveden iz retikulocita zeca. U istom sistemu, međutim, pronašli su sintezu virusnog M-proteina (Vol. Ch. 2) na RNK šablonu izolovanom iz inficiranih ćelija. Dakle, trenutno je nemoguće odgovoriti na pitanje da li se kao šabloni za sintezu proteina koriste samo viriope ili samo komplementarni, ili neki RNA fragmenti jednog tipa i neki RNA fragmenti drugog tipa. virusima gripa je teško primijeniti definiciju "negativnog" ili "pozitivnog" virusnog lanca, kao što je predložio Baltimore (1971).
B. SINTEZA VIRUSNIH PROTEINA IN VIVO
Proučavanju sinteze virusnih "proteina" pogoduje činjenica da se u inficiranoj ćeliji sinteza ćelijskih polipeptida zamjenjuje sintezom specifičnom za virus. U ćelijama fibroblasta kokošjeg embrija inficiranih HPV-om (Joss et al., 1969; Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973), iu ćelijama BHK 2IF inficiranih WSN sojem virusa gripe (Lasarowitz et al., 1971), 4 sati nakon infekcije, skoro
samo jedan virusni protein (31). Nešto raniji istraživači su uočili sintezu tri ili četiri polipeptida kod inficiranih grinja (Taylor et al., 1969; Joss et al., 1969; Holland i Kiehn, 1970; White et al., 1970). Kasnije su otkriveni i drugi polipeptidi (Lazorowitz et al., 1971; Skehel, 1972; Klenk et al., 1972b; Krug i Etkind, 1973). Općenito, svi strukturni α-proteini pronađeni su u inficiranim stanicama: jedan ili dva P-proteina, nukleokapoidna podjedinica NP, membranski protein M, hemaglutinijum glikoprotein u necijepljenom (HA) i cijepanom (HA1 i HA2) obliku i NA podjedinica .
Pored virionskih proteina, opisani su jedan ili dva nestrukturna proteina (NS).
Postoje značajne razlike<в уровнях синтеза отдельных вирусных полипептидов. NP- и NS-полипептиды обычно первыми обнаруживаются в зараженных «летках. Skehel (1973) предположил, что полипептиды Р2, NP и NS, которые первыми обнаруживаются в «клетках, зараженных ВЧП, являются
produkti RNA fragmenata koji nastaju tokom selektivne transkripcije virion polimerazom tri fragmenta virusnog genoma. Kada su ćelije inficirane u prisustvu cikloheksimida i dodana pulsna oznaka nakon uklanjanja antibiotika, pronađena su samo ova tri polipeptida. Na osnovu toga, pretpostavljeno je da su molekule RNK za ove komponente formirane uz pomoć unesene virion lolimeraze u procesu primarne transkripcije. Od 4. do 6. sata nakon infekcije pilećih fibroblasta MPS, nivo sinteze M-proteina raste, dok se sinteza NS-lolileptida smanjuje (Skehel, 1972, 1973). Dakle, nivoi sinteze jolipida mogu se pojedinačno kontrolisati i mogu varirati tokom ciklusa rasta.
Osim cijepanja HA polipeptida na HA1 i HA2, nema dokaza da su virus specifični polipeptidi gripe rezultat cijepanja velikih prekursora (Taylor et al., 1969; Lazarowitz et al., 1971, Skehel, 1972; Klenk , Rott, 1973.).
Nedavno su dobijene nove informacije o lokalizaciji virusnih komponenti u inficiranim ćelijama korišćenjem autoradiografije (Becht, 1971) ili tehnika frakcionisanja ćelija i gel elektroforeze (Taylor et al., 1969, 1970). Prema ovim studijama, sinteza svih virusnih proteina se očigledno odvija u citoplazmi. Prethodne studije lokalizacije nukleoproteinskog antigena imunofluorescencijom tumačene su kao naznake da se sinteza dešava u jezgru sa naknadnim oslobađanjem antigena u citoplazmu (Liu, 1955; Breitenfeld i Schafer, 1957; Holtermann et al., 1960). Međutim, jasno je da imunofluorescencija određuje akumulaciju antigena, a ne njegovu sintezu (vidjeti dio IV, B, 2).
1. RNA polimeraza
Aktivnost RNK-polimeraze zavisne od virusa može se otkriti u ćelijama inficiranim virusom gripe između 13D i 3h nakon infekcije, u zavisnosti od ćelijskog sistema koji se koristi (Scholtissek i Rott, 1969a; Skechel i Burke, 1969; Ruck et al. ., 1969; Mahy i Bromley, 1970). Ovo je prva otkrivena aktivnost specifična za virus nakon infekcije. Većina virusne aktivnosti lolimeraze je otkrivena u mikrosomalnoj frakciji; dio ove aktivnosti ostaje u jezgrima i odatle se ne može ukloniti čak ni intenzivnim pranjem. Ne postoje fundamentalne razlike u kinetici ispoljavanja ili u potrebnim kofaktorima između nuklearnih i mikrosomalnih enzima (Scholtissek i Rott, 1969a; Mahy et al., 1975).
Daljnjim frakcionisanjem citoplazme u stepenastom gradijentu saharoze metodom Caliguiri i Tamm (1970), aktivnost polimeraze je pronađena u grubim membranama (Compans i Caliguiri, 1973; Klenk et al., 1974a).
Budući da je aktivnost virusne polimeraze otkrivena u pročišćenim virusnim česticama (vidi Poglavlje 5), postavlja se pitanje s kojim se od virusnih "proteina" može povezati. Jedini virus specifičan proizvod povezan sa aktivnošću polimeraze bio je RNP antigen (NP protein plus virusna vRNA, određen fiksacijom komplementa). Svi pokušaji uklanjanja RNK iz ovog kompleksa rezultirali su potpunim gubitkom aktivnosti enzima (Schwarz i Scholtissek, 1973). P-protein je predložen kao kandidat za ulogu virusne polimeraze (Kilbourne et al., 1972). Kada je enzimski "kompleks označen in vivo aminokiselinama" izolovan iz ćelija inficiranih virusom gripa i pročišćen oko 35 puta, elektroforetska analiza je u početku otkrila samo Np-bijelu u ovom kompleksu.< (Compans, Caliguiri, 1973). Впоследствии, однако, при других условиях введения;метки удалось обнаружить и Р-белок (Caliguiri, Compans, 1974). С другой стороны, Klenk и соавт. (1974) обнаружили Р-белок в цитоплазматическом золе, "который не обладает полимеразной активностью (Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). Эти наблюдения могут означать, что Р-белок осуществляет свою (Предполагаемую активность ферментов только при связывании с РНП-антигеном.
Malo je vjerovatno da sam RNP antigen ima aktivnost polimeraze, jer hiperimuni serum protiv RNP antigena ne inhibira aktivnost polimeraze, dok je rekonvalescentni serum, koji može sadržavati antitijela na polimerazu, inhibira (Scholtissek et al., 1971). Ovaj rekonvalescentni serum (koji je dobijen od životinja koje su bile zaražene virusima gripe A) inhibirao je aktivnost polimeraze svih proučavanih sojeva virusa gripe A, ali nije inhibirao aktivnost polimeraze virusa influence B. Sva ova zapažanja su u skladu s idejom da RNP-antigen (BPHK + NP = = protein), može poslužiti kao šablon za sintezu ecRNA-
2. Nukleokapsidni protein
NP protein se vezuje za virusnu RNK, formirajući RNP antigen.To važi za NP protein izolovan ne samo iz viriona, već i iz inficirane ćelije (Schafer, 1957).
otprilike 3 sata nakon infekcije, jedan sat prije pojave hemaglutinina (Breitenfeld, Schafer, 1957). Nakon ovog vremena, titar RNP antigena se ne povećava značajno. Ovo može biti zbog ravnoteže između nove sinteze i inkorporacije u zrele čestice. Prema etiketi, NP protein se može otkriti u inficiranim ćelijama unutar 2 sata nakon infekcije (Scholtissek i Rott, 1961; Krug, 1972).
Uz pomoć fluorescentnih antitijela, RNP antigen se prvo otkriva u jezgrima. Kasnije se pojavljuje iu citoplazmi (Breitenfeld i Schafer, 1957). Pod određenim uslovima, kao što je abortivna infekcija (Franklin i Brietenfeld, 1959), u prisustvu p-fluorofenilalanina (Zimmermann i Schafer, 1960), ili pod uslovima von Magnusovog fenomena (Rott i Scholtissek, 1963), RNP - antigen ostaje u jezgrima.
Rano nakupljanje RNP antigena u jezgrima inficiranih ćelija ne znači da se NP protein sintetizira i unutar jezgara. Autoradiografske studije, kao i upotreba metoda frakcioniranja ćelija, ukazuju na citoplazmatsku sintezu ovog i drugog proteina bogatog argininom i njihov brzi transport iz citoplazme u jezgra (Taylor et al., 1969, 1970; Becht, 1971).
U ekstraktima inficiranih ćelija, određeni dio RNP antigena sadrži ecRNA (Pons, 1971; Krug, 1972; Krug i Etkind, 1973), iako se samo jedan tip RNK nalazi u virusnim česticama (što proizilazi iz odsustva bilo kakvog samohibridizacija vRNA) (Scholtissek, Rott, 1971; Pons, 1971). Nije moguće odlučiti da li RNP antigen koji sadrži ecRNA ima specifičan značaj u procesu virusne reprodukcije ili je to samo artefakt koji se pojavljuje u procesu frakcioniranja stanica. Pokazalo se da se oba RNK lanca jednako dobro vezuju za NP protein in vitro (Scholtissek i Becht, 1971). Dakle, ako postoji bilo koji slobodni NP protein i slobodna scRNA, odgovarajući RNP antigen se odmah formira tokom procesa homogenizacije. Virionska RNK može biti istisnuta iz RNP antigena polivin "Ilsulfat O" M (Pons et al., 1969). Stoga se može testirati da li je supstitucija različitih virusnih RNK u RNP antigenu u ćelijskim homogenatima izvodljiva. Iz promjena u sastavu baza virusne RNK označene u različitim vremenskim periodima sa 32P i izolovanih iz citoplazmatskog RNP antigena, Krug (1972) zaključuje da neki dio ecRNA, prije nego što je uključen u RNP antigen, postoji u oblik bez NP- vjeverica. Inkorporacija 32P u RNK životinjske ćelije se dešava sa značajnim kašnjenjem zbog prilično sporog ugrađivanja obeleženog fosfora "u" (x-položaj nukleozid trifosfata (Scholtissek, 1965). Dok se ne izvrše odgovarajuća podešavanja za izračunavanje promena u sastavu
Razlozi nisu navedeni, podatke Kruga (1972) treba tumačiti s oprezom.
Krugova (1972) kinetička analiza "pojave RNP antigena u jezgrima i citoplazmi" sugerira da RNP antigen koji se akumulira u jezgrima nije prekursor RNP antigena koji se nalazi u citoplazmi.
3. Nestrukturni proteini
Nekoliko nestrukturnih virus-specifičnih proteina nepoznate funkcije je opisano za inficirane stanice. Jedan od njih, sa relativnom molekulskom težinom od 25 000, akumulirajući se u "velikim količinama", označen je kao NS (Lazarowitz et al., 1971). U poliakrilamidnim gelovima ima brzinu migracije blisku onoj M-proteina. Međutim, izgleda da su oba proteina nezavisna jedan od drugog, kao što se vidi iz razlika u njihovim peptidnim mapama.Velike "količine NS-" proteina su pronađene u jezgrima (Lazarowitz et al., 1971; Krug, Etkind, 1973). Ovi nalazi su u skladu sa podacima prethodnih imunofluorescentnih studija Dimocka (1969), koji je primetio "svetlo bojenje jezgara sa antiserumom specifičnim za nestrukturne virusne antigene, a ovo bojenje je verovatno odražavalo prisustvo NS-" proteina. otkrili da je ovaj protein također glavni protein specifičan za virus u frakcijama slobodnih ribozoma vezanih za membranu izolovanih iz inficiranih ćelija (Pons, 1972; Compans, 1973; Klenk et al., 1974a). Čini se da povezanost NS-a sa ribozomima zavisi od tonaže (Krug i Etkind, 1973). U puferima niske jonske snage OVAJ nolipaptid se adsorbirao na obje ribosomske podjedinice, dok je dodavanjem soli iz njih uklonjen.
Nedavna studija (Gregoriades, 1973) izazvala je neke sumnje u vezi identifikacije NS kao nestrukturnog polipeptida različitog od polipeptida virion M. iz cijelih inficiranih ćelija, α-jezgara ili polisoma. Analiza triptičkih proizvoda M-proteina, također kao nuklearni i β-proteini povezani sa ribozomima, dovelo je do mnogih podudarnosti, sugerirajući da su M- i NS-proteini identični.Neophodne su, međutim, dodatne informacije da bi se uvjerljivo objasnili ovi rezultati.
Osim NS-a, mogu postojati i druge nestrukturne komponente specifične za virus, iako nijedna od njih. nije dovoljno okarakterisano. Koristeći antiserum usmjeren protiv nestrukturnih virusnih antigena,
Dimmock i Watson (1969) istaložili su radioaktivno označene polipeptide iz inficiranih ćelija. Elektroforetskom analizom u poliakrilamidnom gelu utvrđeno je prisustvo nekoliko nestrukturnih polipeptida čija glavna komponenta odgovara NS. Jedna od preostalih nestrukturnih komponenti migrira brže i može odgovarati komponenti relativne molekulske težine od 10 000 do 15 000 koju su opisali Skehel (1972), Krug i Etkind (1973).
4. Membranski M-protein
M-protein, koji "oblaže unutrašnju površinu lipidnog dvosloja ovojnice i bogat je virionom, nalazi se u inficiranim stanicama u relativno malim količinama. Ovo sugerira ne samo kontrolu sinteze M-belma, već i mogućnost da je ova sinteza faza koja ograničava brzinu reprodukcije virusa (Lazarowitz et al., 1971.) Ovaj koncept podržavaju podaci da na temperaturi od 29 °C, na kojoj je formiranje virusa potisnuto, M -protein je jedini (virusopedski) protein koji se ne može otkriti u inficiranim stanicama (Klenk, Rott, 1973).
M-protein (može se naći na glatkim i plazma membranama inficiranih ćelija (Lazarowitz et al., 1971; Corn-pans, 1973a; Klenk et al., 1974a). Ovi podaci ukazuju na afinitet ovog proteina za membrane.
5. Hemaglutinin
Hemaglutinin se sintetizira kao veliki glikoprotein - prekursor HA, koji se potom cijepa na dva manja glikoproteina: HAi i HA2" (Lazarowitz" tal., 1971). Cijepanje, koje se može potisnuti inhibitorima proteaze, Rott (Klenk, Rott). 1973), vrši se očigledno proteolitičkim enzimima ćelije domaćina (Lazarowitz et al., 1973) Stepen cijepanja zavisi od soja virusa, ćelije domaćina, nivoa citoiatskog efekta i prisustva ili odsustva seruma u medijum (Lazarowitz et al., 1971, 1973a, b Klenk i Rott 1973 Stanley et al. serum U prisustvu seruma, međutim, WSN hemaglutinin se takođe cijepa.
Sistem se odvija na plazma membrani (Lazaro-witz et al., 1973a). U sistemu VChP, mehanizam takvog cijepanja je, očigledno, drugačiji. Cepanje se „događa na intracelularnim membranama i plazminogen u ovom slučaju nije neophodan (Shchepk et al., 1974a). Stupanj cijepanja naglo opada tri 25 °C (Klenk, Rott, 1973).
Cepanje HA nije neophodan uslov za aktivnost hemaglutinacije i za sklapanje viriona (Lazarowitz et al., 1973a; Stanley et al., 1973), ali nedavne studije su "našle da je neophodno za infektivnost (Klenk et al., 1975b). ) Ovi podaci su u skladu s hipotezom da, osim svoje uloge u adsorpciji, HA* ima još jednu funkciju u infektivnom procesu i da je za tu funkciju neophodno cijepanje.ćelije domaćini i da su čestice koje sadrže nerazcijepljenu HA niske infektivnosti sugeriraju da Raspon domaćina i širenje infekcije virusom gripe zavise od prisutnosti proteaze ćelije domaćina kao aktivirajućeg enzima.
U eksperimentima na frakcioniranju "ćelija inficiranih s
virusa influence, ustanovljeno je da su HA glikoproteini uvijek ak
povezane s membranama (Compans, 1973a; Klenk et al.,.
1974a). Intracelularna lokalizacija ovih proteina i njihov trenutak
voki-toki od grubih membrana do glatkih endolazmatskih
retikuluma i na plazma membrane će biti de
su detaljno opisani u odjeljku VII, B. . .,
6. Neuraminidaza
Pronađen je virusni NA* kao aktivni enzim,
3 sata nakon infekcije u horion-alantoičnoj membrani
nah, a ekstrapolacijom je ustanovljeno da je početak njenog sin
teza se javlja 1-2 sata nakon infekcije (Noll et al.,
1961). Intracelularnu lokalizaciju NA* proučavao je
frakcioniranje ćelija, i otkrio da je to očigledno
mu, slično lokalizaciji HA* (Compans, 1973a; Klenk et al.,
1974a). NA* je pronađen u vezi sa membranama,
izvedeno iz glatkog endoplazmatskog retikuluma
prilikom određivanja biološkom aktivnošću i analizom
zu u poliagrilamidnom gelu. Pronađena je aktivnost enzima
den također u frakcijama koje sadrže grube membrane
nas. Ovi podaci su u skladu sa onima dobijenim sa
imunofluorescencija (Maeno, Kilbourne, 1970). Nakon 4 sata
nakon infekcije, yairaminidaza se može otkriti u cito
plazma; kasnije se čini da se koncentriše na peri
cell feria.
V. SINTEZA UGLJIKOHIDRATA
Ugljikohidrati su uključeni u formiranje glikoproteina i glikolida omotača virusa gripe (Klenk et al., 1972a). Glikolipidi miksovirusa (izvedeni iz plazma membrana ćelije domaćina (Klenk, Choppin, 1970), „ali nije utvrđeno šta je pretežno (uključeno u virion: već postojeći ili novosintetisani glikolipidi.
Upotreba radioaktivnih prekursora kao što su glukozamin, manoza, galaktoza i fukoza, koji su specifično ugrađeni u virusne glmkopeltide, pokazala je da se ugljikohidratni bočni lanci ovih glikopeptida ponovo sintetiziraju tijekom infekcije (Haslam et al., 1970; Cornpans et al. , 1970a; Schwarz i Klenk, 1974). Eksperimenti frakcioniranja ćelija dali su dodatne informacije o mjestima glikozilacije virusnih glikoproteina.Glukozamin je povezan s HA polipeptidom u frakcijama i glatkih i grubih citoplemičkih membrana; međutim, fukoza je povezana s HA u glatkim, ali ne i grubim membranama (Compans, 1973b Supresija sinteze proteina puromicinom gotovo odmah zaustavlja inkorporaciju glukozamina, dok fukoza nastavlja da se inkorporira oko 10-15 minuta (Stanley et al., 1973).<и НА2 содержат, по-видимому, полный состав маннозы « глюкозамина, тогда как содержание фукозы и галактозы значительно выше в продуктах расщепления (Klenk et al., 1975a; Schwarz, Klenk, 1974). Эта наблюдения предполагают, что биосинтез углеводных боковых целей гликопротеинов НА осуществляется по стадиям с различными остатками Сахаров, добавляемыми в разных участках клетки. Глюкозамин и манноза (присоединяются, по-видимому, к полипептидам НА на шероховатых мембранах вскоре после или даже в процессе синтеза поляпептида, в то время как фукоза, вероятно, прикрепляется позже с помощью трансфераз, присутствующих в гладких мембранах.
Ove glikoziltransferaze su vjerovatno ćelijski enzimi. Posljedično, ugljikohidrati (dio glikoproteina je očigledno određen od strane ćelije domaćina. Međutim, postoje dokazi da, pored ovih enzima ćelije domaćina, virusna NA* igra značajnu ulogu u formiranju bočnih lanaca ugljikohidrata. ustanovljeno je da na površini ovojnica miceovirusa nedostaje neuraminska kiselina (Klenk i Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970), dok je u virusnim ovojnicama koje ne sadrže ovaj enzim ovaj ugljikohidrat čest sastojak (Klenk i Choppin, 1971. ; McSharry i Wagner, 1971; Renkonen et al., 1971) Ovi podaci sugeriraju da
Djelovanje neuraminske kiseline je bitno obilježje miksovirusa. Nedavno je pokazano da je NA* odgovoran za uklanjanje neuraminske kiseline iz omotača virusa gripe, čime se sprječava stvaranje receptora na ovoj virusnoj ovojnici koji bi inače doveli do stvaranja velikih agregata virusnih čestica (Palese et al., 1974. Ovi podaci podržavaju koncept da je ugljikohidratni dio HA* kao glavnog površinskog glikoproteina proizvod kombiniranog djelovanja (ćelijske transferaze i virusna NA*. Svojim djelovanjem virus može uvesti modifikaciju specifičnu za virus u (u početku specifičnu za domaćina, složenu strukturu modifikacije ugljikohidrata, koja je, prema očigledno esencijalnoj za -biološku aktivnost virusa.
D-glukozamin i 2-deoksi-0-glk>koza inhibiraju stvaranje biološki aktivnih HA*, NA* i infektivnog virusa (Kilbourne, 1959; Kaluza et al., 1972). Biohemijske studije su pokazale da se ovi šećeri takmiče sa biosintezom virusnih glikogroteina (Ghandi et al., 1972; Klenk et al., 1972b). U prisustvu ovih inhibitora, veličina glikoproteina HA se smanjuje.Stopa smanjenja zavisi od doze.Tako, sa povećanjem koncentracije šećera, glikoprotein HA sa relativnom molekulskom težinom od 76.000 postepeno prelazi u jedinjenje sa molekulskom težinom. od 64 000, koji je označen kao HA0 (Klenk et al., 1972b; Schwarz, Klenk, 1974) Pomak molekularne težine je paralelan sa smanjenjem sadržaja ugljikohidrata i pokazalo se da protein HA0 gotovo ne sadrži ugljikohidrate (Schwarz, Klenk, 1974). Ovi rezultati pokazuju da je HA0 nepotpuno glikoziliran ili neglikoziliran polipeptidni lanac HA glikoproteina i da je "inhibicijski efekat D-glukoza amina a i 2-deoksi-0-glukoze posredovan oštećenjem glikozilacije. HA0 polipeptid je povezan sa membranama, poput normalne HA. Takođe migrira iz grubog u glatki ejadoplastični retikulum, gde se cepa na polipeptide HA01 i HA02. vjerovatno nije bitno za afinitet ovog polipeptida za membranu. Međutim, nedostatak hemaglutinacijske aktivnosti u inficiranim stanicama sugerira da ne-glikozilirani protein nije u stanju da se veže za receptore.
VI. SINTEZA LIPIDA
Kao i svi virusi s omotačem, virus gripe dobiva svoje lipide korištenjem lipida stanice domaćina. Ovaj stav potvrđuju sljedeća zapažanja.
Denia. Utvrđeno je da je sastav lipida virusa influence sličan onom u ćeliji domaćinu (Ambruster i Beiss, 1958; Frommhagen et al., 1959). Lipidi ćelije domaćina, radioaktivno obilježeni prije infekcije, ugrađeni su u virusne čestice (Wecker, 1957). Prilikom uzgoja virusa u različitim ćelijama domaćinima, otkrivaju se modifikacije virusnih lipida (Kates et al., 1961, 1962). Općenito, lipidi virusa (koji pupolje sa površine ćelije blisko odražavaju lipidni sastav plazma membrane ćelije domaćina (Klenk i Choppin, 1969; 1970a, b; Renko-nen et al., 1971). osfolilidi u fibroblastu pilića ćelije su ostale nepromijenjene 7 sati nakon infekcije virusom gripe, nakon čega je sva sinteza lipida potisnuta (Blough et al., 1973). Ova supresija vjerovatno nije primarni efekat, već može biti sekundarna u odnosu na inhibiciju RNK ili sintezu proteina, ili na ".druge citolitičke efekte.
Dakle, na osnovu do sada dobijenih rezultata može se pretpostaviti da se sinteza virusnih lipida odvija kroz normalne stanične procese biosinteze lipida, a virusni omotač nastaje ugradnjom lipida iz plazma membrane ćelije domaćina.
VII. MONTAŽA (vidi i poglavlje 2)
A. FORMIRANJE NUKLEOKAPSIDA
Kao što je već spomenuto, najvjerovatnije je da se nukleokapsidni protein sintetizira u citoplazmi. Očigledno je tamo kratko vrijeme prisutan u slobodnom obliku, a zatim se povezuje s virusnom RNK, formirajući nukleokapside (Klenk et al., 1974; Compans i Caliguiri, 1973). Budući da se NP protein brzo inkorporira u nukleokapside, RNK se može odabrati iz n-reformisanog skupa (Krug, 1972). Zbog male veličine nukleokapsida virusa gripe, oni se ne mogu precizno identificirati u inficiranim stanicama pomoću elektronske mikroskopije. Grozdovi niti ili vlakana prečnika oko 5 nm, uočeni u citoplazmi, verovatno predstavljaju virusne ribo-nukleoproteine (Apostolov et al., 1970; Compans et al., 1970b).
Dostupni podaci ukazuju da se RNA genom viriona virusa influence sastoji od 5-7 fragmenata (vidi Poglavlje 6).
Stoga, svakoj infektivnoj čestici treba barem jedna kopija svakog fragmenta. Hirst (1962) pre-
sugerirao da se nukleokapsidi iz intracelularnog skupa mogu uključiti u (virione slučajno. Udio "infektivnih viriona u E populaciji može se povećati uključivanjem dodatnih RNA fragmenata u prosječni virus (Compans et al., 1970). Na primjer, ako pet različitih RNA fragmenata, svaka virna sadrži ukupno 7 fragmenata uključenih u slučaj viriona, tada bi otprilike 22% viriona trebalo biti zarazno. Dokazi za nasumično uključivanje RNA fragmenata potkrijepljeni su nedavnim zapažanjima Hirsta (1973. ) da u virusnoj populaciji dolazi do rekombinacije između čestica koje ne stvaraju plak. Sposobnost takvih čestica da učestvuju u rekombinaciji može se objasniti odsustvom jednog ili više fragmenata u česticama, dok se fragmenti koji nedostaju mijenjaju od jedne čestice do čestice. drugi, dakle, pogodna gnijezda defektnog virusa mogu formirati rekombinante.
B. PROCES PUPANJA VIRUSA
Kao i većina virusa sa omotačem, virus gripe se okuplja na prethodno formiranim ćelijskim membranama; montaža se vrši pupanjem iz plazma membrane. Prvu demonstraciju oslobađanja virusa iz "ćelije procesom koji nije uključivao lizu" predstavili su Murphy i Bang (1952) u ranim elektronskim mikroskopskim studijama ćelija inficiranih virusom influence. ■ sferične strukture. Tokom formiranja "infektivnog virusa" unutar ćelija nisu uočene nikakve virusne čestice i stoga je bilo jasno da su virusne čestice formirane na površini ćelije. Koristeći antitela obeležena feritinom, Morgan et al. virusni antigen u ona područja u kojima se virus formira. Kasnije studije elektronske mikroskopije su pokazale da površina virusa koji pupa sadrži istu membranu kao i ćelija domaćin sa slojem izbočina koje odgovaraju virusnim "šiljcima" na vanjskoj površini. virusne membrane, nedostaje dodatni elektronski gust sloj na površini ćelije, koji se verovatno sastoji od M-iolipeptida (Bachi et al., 1969; Compans i Dimmock, 1969; Apostolov et al., 1970).
Studije elektronskim mikroskopom dale su osnove da se ■ sugeriše redosledom kojim se virusne komponente as-
socijaliziraju se na ćelijskoj membrani (Bachi et al., 1961; Compans i Dimmock, 1969; Compans et al., 1970b).
Prvo se pojavljuju proteini virusne ovojnice, koji su uključeni u neke regije membrane, koje bi trebale imati normalnu morfologiju; međutim, uočena specifična adsorpcija eritrocita na ove regije membrane ukazuje na prisustvo HA proteina ovdje. Tada se, očigledno, M-protein (povezuje sa unutrašnjom površinom takvih područja membrane, formirajući sloj guste elektronima. Nadalje, ribo-nukleoprotein se specifično vezuje za membranu u tim područjima i proces pupanja se odvija savijanjem i protruzija segmenta membrane i okolnog ribonukleoproteina Podaci elektroforeze poliakrilamidnog gela takođe podržavaju ideju da se proteini omotača povezuju sa plazma membranom brže od RNP-ova (Lazarowitz et al., 1971.) nalaze se u pročišćenim virionima.Kao što je već pomenuto, Ostaci neuraminske kiseline su odsutni u ljusci čestica virusa gripe koji pupaju, ali su prisutni u susjednim dijelovima ćelijske membrane (Klenk et al., 1970).
Ovi podaci dokazuju oštar prijelaz u kemijskom sastavu između ljuske virusne čestice koja pupa i susjedne ćelijske membrane.
Međutim, s druge strane, važna karakteristika procesa pupanja je da je virusna ovojnica kontinuirana sa plazma membranom ćelije domaćina i morfološki joj je slična (Compans i Dimmock, 1969). Kao što je spomenuto, lipidi u ovim membranama imaju vrlo blisku sličnost sa membranskim lipidima ćelije domaćina. Ova zapažanja sugeriraju da se lipidi u intaktnoj plazma membrani lako mijenjaju s lipidima u virusnim česticama koje pupaju radijalnom difuzijom.
Stoga se omotač viriona koji pupa formira od malog dijela ćelijske membrane modificiranog da uključuje proteine ovojnice viriona. Ovaj koncept, naravno, ne podrazumijeva potrebu da se sintetiziraju sve komponente omotača na plazma membrani.
Zaista, odavno je poznato da komponente omotača moraju migrirati na značajne udaljenosti od jednog ćelijskog mjesta do drugog kako bi došle od mjesta svoje biosinteze do mjesta sklapanja membrane. Breitenield i Schafer (1957) su pokazali da se u ćelijama inficiranim virusom gripe, HA* može prvo vidjeti
staviti u sve dijelove ćelije i da je lokalizovan u perinuklearnoj zoni u povećanoj -koncentraciji. Kasnije, HA* se akumulira u "perifernoj regiji" zareza i može se pokazati i u tankim filamentima koji strše iz membrane.
Ideja da komponente omotača migriraju iz unutrašnjosti ćelije na površinu nedavno je potvrđena i proširena nizom studija koje koriste frakcioniranje ćelija i analizu virusnih proteina u različitim ćelijskim frakcijama. Ovi radovi također sugeriraju da se HA glikoprotein, a moguće i drugi proteini omotača, sintetiziraju na grubom endoplazmatskom retikulumu (Compans, 1973a; Klenk et al., 1974). Kao što je otkriveno u eksperimentima praćenja pulsa, nakon nekoliko minuta, HA se već nalazi u membranama glatkog endoplazmatskog retikuluma (Compans, 1973a; Stanley et al., 1973; Klenk et al., 1974) i u plazma membrani (Stanley et al., 1973). Iako eksperimenti za potjeranje od glatkog endoplazmatskog retikuluma do plazma membrane nisu izvedeni, čini se vjerojatnim da HA migrira iz grubog endoplazmatskog retikuluma do plazma membrane, zaobilazeći glatki endoplazmatski retikulum. Treba napomenuti da su tokom čitavog vremena takve migracije HA i drugi proteini omotača komponente membrana duž kojih se kreću; OBI se nikada ne nalaze kao otopljeni proteini.
Frakcije glatkih membrana, za koje se vjeruje da prvenstveno potiču iz endoplazmatskog retikuluma, sadrže sve glavne proteine omotača (Compans 1973a; Klenk et al., 1974). Međutim, njihove relativne količine se ovdje razlikuju od onih u plazma membrani i virionu (Stanley et al., 1973; Klenk et al., 1974). Odnos M-proteina i NA likoprotektora veći je u ovojnici zrelog viriona nego u membranama endolazmatskog retikuluma. Ovi podaci sugeriraju da se samo mali broj membrana koje nose HA glikoprotein pretvaraju u virusnu ovojnicu, odnosno frakcije membrana koje sadrže proteine bez ugljikohidrata. Kao što je već spomenuto, sinteza M-proteina može biti faza koja ograničava proces sastavljanja virusa.
Razlika u brzini sinteze različitih proteina ovojnice podržava "hipotezu da je sastavljanje ovojnice proces u više faza. Pitanje procesa formiranja HA*, uključujući sekvencijalno dodavanje ugljikohidratnog dijela i proteolitičko cijepanje tokom migracije primarnog genskog proizvoda, u skladu je sa ovim konceptom.
VIII. OSLOBAĐANJE VIRUSA GRIPA
Problem oslobađanja virusa gripe iz ćelije domaćina,
čini se da je usko povezan s problemom funkcije virusa
NA*, o čemu je ranije već bilo detaljno razmotreno (vidi
slučajevi V i pog. 4). Da ovaj enzim igra bitnu ulogu
ulogu u oslobađanju virusa, proizašla iz sposobnosti anti
tijela specifična za NA* za suzbijanje takvog oslobađanja (Se-
do, Rott, 1966; Webster et al. G968). Štaviše, ova antitela
spriječiti eluiranje virusa iz eritrocita (Brown, Laver,
1968). Bakterijski NA* koji nije inhibiran anti-antitijelima
lamy do virusnog NA*, može osloboditi virus iz stanica,
tretirani takvim antitelima (Compans et al., 1969;
Webster, 1970). S druge strane, dvovalentna antitijela
do NA također izazivaju agregaciju virusa (Seto, Chang, 1969;
Compans et al., 1969; Webster, 1970), dok je monovalentna anti
tijela ne sprječavaju oslobađanje virusa, iako inhibiraju
preko 90% aktivnosti neuraminidaze (Becht et al., 1971).
Svi ovi podaci zajedno upućuju na to
dvovalentna antitijela sprječavaju oslobađanje virusa
vezivanjem za antigene prisutne na
ćelijske površine, te inhibiranjem aktivnosti fer
policajac. Uloga neuraminidaze u oslobađanju skrining virusa
ili takođe Palese et al. (G974), koji je utvrdio da je ovaj fer
neophodan je za uklanjanje neuroamilne kiseline iz vi
Ruska površina kako bi se izbjegla agregacija viriona - tada -
uvale na površini ćelije.
IX. NEISPRAVNI OBLICI UZGOJA
A. ABORTIVNA REPRODUKCIJA OVISNA O ĆELIJAMA DOMAĆINA
Virusi gripa mogu inficirati širok spektar ćelija domaćina. Međutim, u mnogim inficiranim ćelijama, prinos infektivnog potomstva je ili vrlo nizak ili se ne može detektovati, iako se virusne komponente mogu detektovati u normalnim titrima.Ovaj tip prekida infektivnog ciklusa koji zavisi od ćelije domaćina naziva se abortivna infekcija. inficirani u mozgu ne-neurotropnim sojevima virusa gripe (Schlesinger, 1953). Što je veća doza virusa primijenjena, to je veća količina novosintetiziranog hemaglutinina. Opisano je nekoliko drugih sistema virusa virusa gripe A ćelija-domaćin u kojima proizveden je samo RNP-I.antigen i hemaglutinin, ali ne i infektivni virus.U svim ovim do sada proučavanim sistemima, RNP-antigen se akumulirao u jezgru i nije detektovan.
detektovan je fluorescentnim antitelima u citoplazmi (Henle et al., 1955; Franklin i Breitenfeld, 1959; Ter Meulen i Love, 1967; Fraser, 1967).
B. FENOMEN VON MAGNUS
U toku serijskih prolaza "virusa gripe u multiplicitetu većem od 1 (Barry, 1961), formiraju se sve veće količine nepotpunog virusa koji izlaze iz ćelije domaćina (von Magnus, 1951, 1952). Ove virusne čestice imaju površinu struktura vrlo slična strukturi infektivnog virusa, imunogeni su i uzrokuju homolognu interferenciju, sadrže manje RNA i RNP antigena, pokazuju niži omjer infektivnosti prema hemaglutinacijskoj aktivnosti i sadrže više lipida nego kompletne virusne čestice (von Magnus, 1954; Isaacs, 1959; Pauker et al., 1959; Rott i Schafer, 1961; Rott i Scholtissek, 1963).
U analizi RNK nekompletnog virusa ustanovljeno je da virusna RNK sa relativno visokom [molekulskom težinom ili odsutna ili je prisutna u njima u smanjenim količinama, dok se količina RNK niske molekularne težine povećava (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969; Nayak, 1969).
U ćelijama inficiranim drugim nerazrijeđenim prolazom virusa gripe, prisutne su sve genetske informacije virusa, budući da je ecRNA izolirana iz ovih "ćelija" sposobna konvertirati, nakon hibridizacije, označenu RNK izoliranu iz infektivnog virusa u potpuno RNA-azorezistivan oblik (Scholtissek, Rott, 1969b). Dakle, povećanje količine RNK niske molekularne težine u nepotpunim česticama može biti posljedica RNK visoke molekulske mase, koja se može uključiti u ove čestice u obliku uništenih i stoga nefunkcionalnih molekula. Ova ideja je potkrijepljena dokazima da sa žednim nerazrijeđenim prolazom, sposobnost proizvodnje infektivnog virusa prvo se smanjuje, nakon čega se smanjuje sinteza hemaglutinina, neuraminidaze i konačno RNP antigena (Scholtissek et al., 1966).
Nayak (1972) je otkrio da je tokom prvog pasaža s velikom multiplicitnošću virus koji se pojavio na početku bio potpuno infektivan i dao je normalan uzorak infektivnih virusnih RNA fragmenata u gradijentu saharoze, dok je virus koji se pojavio kasnije imao RNA profil tipičan za nepotpuni (pozadinski -magnus) virus1.
Oni su obavezni intracelularni paraziti, što znači da ne mogu replicirati ili prenijeti svoje gene bez pomoći. Sama pojedinačna virusna čestica (virion) je inertna. Kada virus inficira ćeliju, koristi enzime i veći dio ćelijske strukture za replikaciju.
Za razliku od onoga što vidimo u procesima diobe stanica kao što je, virusna replikacija proizvodi mnogo potomaka koji uništavaju ćeliju domaćina, a zatim inficiraju druge ćelije u tijelu.
Virusni genetski materijal
Virusi mogu sadržavati jednostruki/dvolančani DNK ili RNK. Vrsta genetskog materijala koji se nalazi u određenom virusu ovisi o njegovoj prirodi i funkciji. Tačna priroda onoga što se događa nakon što je domaćin inficiran varira ovisno o prirodi virusa.
Proces replikacije za viruse s dvolančanom DNK, jednolančanom DNK, dvolančanom RNA i jednolančanom RNA bit će drugačiji. Na primjer, dvolančani DNK virusi obično moraju ući u ćelije domaćina prije nego što se mogu replicirati. Međutim, jednolančani RNA virusi se repliciraju uglavnom u ćelijama domaćinima.
Jednom kada virus inficira domaćina, komponente virusnog potomstva proizvode ćelijske mašine i sastavljanje virusnog kapsida je neenzimski proces. Virusi obično mogu zaraziti samo ograničen broj domaćina. Mehanizam "brava i ključ" je najčešće objašnjenje za ovaj fenomen. Određeni proteini na virusnoj čestici moraju odgovarati određenim receptorskim proteinima na površini ćelije određenog domaćina.
Kako virusi inficiraju ćelije?
Glavni proces infekcije i replikacije virusa odvija se u 6 faza:
- Adsorpcija - virus se vezuje za ćeliju domaćina.
- Ulazak - virus unosi svoj genom u ćeliju domaćina.
- Replikacija virusnog genoma - Virusni genom se replicira pomoću ćelijske strukture domaćina.
- Sklapanje - formiraju se virusne komponente i enzimi koji počinju da se sklapaju.
- Sazrevanje - virusi se razvijaju iz sastavljenih komponenti.
- Izlaz - novi virusi izbijaju iz ćelije domaćina u potrazi za novim žrtvama zaraze.
Virusi mogu zaraziti bilo koju vrstu ćelije, uključujući
KOD FLU IRIS: DOGAĐAJI I PREDVIĐANJA
D.K. Lvov, A.D. Zaberežni, T.I. Aliper
Dmitrij Konstantinovič Lvov, akademik Ruske akademije medicinskih nauka, direktor Istraživačkog instituta za virusologiju po imenu A.I. DI. Ivanovsky RAMS, šef Odsjeka za virusologiju Moskovske medicinske akademije. NJIH. Sechenov. Rukovodilac projekta 05-04-52136, 06-04-48822.
Aleksey Dmitrievich Zaberezhny, doktor bioloških nauka, šef Laboratorije za molekularnu dijagnostiku istog instituta, šef Odeljenja za molekularnu biologiju NPO Narvak.
Taras Ivanovič Aliper, doktor bioloških nauka, rukovodilac Laboratorije za sredstva za specifičnu prevenciju virusnih bolesti istog Instituta, direktor NPO Narvak.
Pogledajte prvu publikaciju članka: Priroda. 2006. br. 6. str. 3–13.
Epidemije gripa se javljaju svake godine i ne doživljavaju se kao nešto izvanredno. Budući da je bolest uzrokovana virusima koji su već poznati imunološkom sistemu, to je
obično se dobro slažu. Pandemija je druga stvar: u ovom slučaju, uzročnik gripe je virus s novim antigenskim i biološkim svojstvima, koji se brzinom munje širi svijetom, pogađa do četvrtine populacije planete i oduzima desetke miliona života. Ova "čuvena" pandemija prošlog veka. Bilo ih je nemoguće predvidjeti, kao što je, međutim, nemoguće navesti tačno vrijeme početka novog.
Međutim, zahvaljujući stalnom praćenju virusa koji kruže među ljudima, domaćim i divljim životinjama, kao i saznanjima stečenim molekularno genetskim metodama, već je moguće predvidjeti pojavu novih varijanti virusa sa tendencijom pandemije. Posljednjih godina identificiran je kandidat za ovu ulogu: krajem 2003. prvobitno nepatogeni ptičji virus H5N1 izazvao je epizootiju gripe među domaćim pticama, koja je ove godine prerasla u panzootiju. Ovaj virus je počeo da zarazi i druge životinje, uključujući ljude, ali se do sada ne može prenijeti s osobe na osobu. Da bi stekao ovu sposobnost, dovoljno je zamijeniti samo jednu aminokiselinu u jednom od virusnih proteina.
Virionske strukture
Virus gripe ima prilično jednostavnu strukturu: to je sferična čestica (virion) prečnika oko 0,13 mikrona, u jezgru, koja sadrži nukleokapsid (molekul RNK upakovan u ljusku M1 proteina), okružen lipidom. membrana (slika 1). U ovu membranu su uronjena tri proteina - hemaglutinin, neuraminidaza i jonski kanal (protein M2), koji igraju glavnu ulogu u infektivnom procesu.
Hemaglutinin je prvi koji dolazi u kontakt sa receptorima ćelije domaćina. Na površini virusne ovojnice predstavljen je u obliku vrlo složenih trimera. Svaki njihov monomer je čvrsto usidren u membrani i sadrži dvije podjedinice - jedna od njih pruža primarni kontakt sa ciljnom ćelijom, druga je odgovorna za fuziju virusne i ćelijske membrane. U gornjem dijelu proteina nalaze se mjesta koja se vezuju za sijaličnu kiselinu, koja je dio receptora ćelije domaćina.
Enzim neuraminidaza cijepa terminalne grupe sijalične kiseline ćelijskih receptora, zbog čega stanica gubi sposobnost prepoznavanja antigena, a virus prodire
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
ulazi u nju endocitozom, uobičajenim načinom isporuke tvari u ćeliju. Kisela sredina endosoma nastalog iz ćelijske membrane aktivira M2 ionski kanal, koji snižava pH unutar virusne čestice, što dovodi do uništenja M1 proteinskog omotača. Istovremeno se aktivira hemaglutinin. Sintetizira se u obliku prekursora, koji u kiseloj sredini prelazi u zrelo stanje - proteolitičkim enzimima ga cijepaju na dvije podjedinice, dok fuzioni peptid skriven unutar trimera mijenja konformaciju, oslobađa se, kreće se do gornjeg kraja. molekula i unosi se u membranu. Virusna ovojnica se spaja s endosomskom, formira se fuzijska pora kroz koju se otvara put stranom genetskom materijalu u citoplazmu. Virusna RNK tada ulazi u jezgro ćelije. Kao rezultat toga, vitalni procesi su poremećeni u ćeliji, a ona sama, koristeći vlastite resurse, počinje proizvoditi virusne proteine. Virusna RNK se odmah replicira i sastavljaju nove virusne čestice koje se oslobađaju iz oštećenih ćelija uz pomoć neuraminidaze (proizvodi njihovog raspadanja izazivaju intoksikaciju organizma i grozničavo stanje) i krvotokom se raznose po cijelom tijelu.
Slika 1. Šema viriona virusa influence. Njegova lipoproteinska membrana prekrivena je bodljama od dva glikoproteina - hemaglutinina i neuraminidaze. Unutra je nukleokapsid, molekula RNK umotana u ljusku proteina M1. Genom se sastoji od osam fragmenata, od kojih prvih šest kodira po jedan protein (hemaglutinin - HA, neuraminidaza - NA, podjedinice RNA polimeraze - PB1, PB2, PA, nukleoprotein
NP), a poslednja dva gena - dva proteina sa jedinstvenim amino sekvencama.
bez kiselina (matriksni proteini - M1, M2 i nestrukturni proteini - HS1, HS2).
Virus koji se razmnožava deprimira hematopoetski i imuni sistem, oštećuje endotel kapilara, što dovodi do povećane vaskularne permeabilnosti i krvarenja do cerebralnog edema sa smrtnim ishodom. Ali to se dešava prilično retko, imuni sistem se obično uključuje – prvo su uključeni faktori urođenog (nespecifičnog) imuniteta, a nakon nekog vremena počinju da se stvaraju specifična antitela koja oslobađaju i pri ponovnoj infekciji štite organizam. od virusa.
Posebnost virusa gripe je velika varijabilnost antigenskih svojstava. Unutrašnji proteini su konstantne strukture i određuju tip virusa (A, B i C). Površinski antigeni su, naprotiv, heterogeni i varijabilni, i to u većoj mjeri
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
penisa, radi se o hemaglutininu (H), koji zajedno sa neuraminidazom (N) određuje podtip virusa (H1N1, H2N2, H3N2, itd.). Antigenska varijabilnost površinskih proteina je posljedica dva genetska procesa - drift i pomaka u virusnom genomu.
Promjene su uzrokovane točkastim mutacijama u genima koji kodiraju hemaglutinin i neuraminidazu i dovode do manjih promjena u strukturi ovih proteina. U pravilu se takve promjene javljaju između pandemija kod svih tipova virusa (A, B i C). Kao rezultat, svake godine se javljaju epidemije, a ne pandemije, jer se zaštita od prethodnog izlaganja virusu održava, iako je nedovoljna.
Promjene se javljaju nakon potpune zamjene gena. To je moguće jer je genom virusa gripe segmentiran - sastoji se od osam fragmenata jednolančane linearne RNK, koji kodira, pored hemaglutinina i neuraminidaze, enzim specifičan za virus (RNA polimerazu, ili transkriptazu, koja se sastoji od tri podjedinice - proteina PB1, PB2, PA), kao i nukleoprotein (NP), matriks (M1 i M2) i nestrukturni (NS1 i NS2) protein. Kada je ćelija istovremeno inficirana sa dva različita soja, segmenti njihovih replicirajućih genoma se miješaju u bilo kojoj kombinaciji, tako da novi virioni sadrže različite skupove gena posuđenih od svakog od originalnih virusa. Takva kombinacija segmenata virusne RNK naziva se genetsko miješanje, odnosno reasortiranje, da se ne miješa s već postojećim pojmom - rekombinacija, tokom koje se genetski materijal preuređuje bilo mehanizmom ukrštanja ili kao rezultat promjene šablona. Promjene pomaka, u pravilu, utječu na antigenu strukturu hemaglutinina, rjeđe - neuraminidaze. Tako se u nepravilnim intervalima (10-40 godina) pojavljuju virusi s novim antigenskim i biološkim svojstvima, uključujući i nove pandemijske varijante.
Vrsta barijere
Među virusima koji mogu izazvati ekstremne epidemijske situacije, protiv kojih je borba u fazi njihovog nastanka teška ili čak nemoguća, posebno su opasni virusi gripe A. Odlikuju se visokom antigenom heterogenošću površinskih proteina i zastupljeni su, prema podacima nomenklatura, prema 16 neuraminidaze (N1-9). Ovi virusi su široko rasprostranjeni u prirodi i mogu zaraziti sve vrste ptica i neke vrste sisara (ljudi, konji, svinje, kitovi, foke itd.). Infekcija sisara se javlja uglavnom kroz respiratorni trakt, ptica - kroz crijeva. Njihova infekcija je najčešće asimptomatska ili u obliku enteritisa, što ukazuje na visok stepen međusobne adaptacije virusa gripe i divljih ptica, koje se mogu smatrati njihovim prirodnim domaćinima. Virus perzistira u vodi, na +22°C - do mjesec dana, na +4°C i niže - duže vrijeme (6-8 mjeseci), stoga je vodeno-fekalni put infekcije glavni mehanizam za održavanje stalne cirkulacije virusa gripe u prirodi.
Unatoč antigenskoj heterogenosti, virusi sa svim poznatim kombinacijama površinskih proteina izolirani su samo od divljih ptica vodenih i poluvodenih kompleksa - pataka, galebova itd. (Sl. 2).
Među ostalim životinjama cirkulišu samo virusi sa određenim skupom površinskih proteina: na primjer, virusi samo tri podtipa hemaglutinina (H1-H3) i dvije neuraminidaze (N1-N2) su donedavno izolirani od ljudi. Sve četiri pandemije 20. veka nastali su zbog novih varijanti promjena ovih podtipova: „španski grip” 1918. godine je uzrokovan virusom gripe A podtip H1N1, „azijski grip” 1957. – H2N2, „hongkonški grip” 1968. – H3N2 i „ruski grip”. gripa” 1977. - H1N1. Svi su reasortanti virusa ptičje i ljudske gripe.
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
Donedavno se vjerovalo da virusi ptičje gripe nisu patogeni za ljude i da, ako su zaraženi, mogu uzrokovati samo konjuktivitis i blagu slabost, u rijetkim slučajevima i blagi respiratorni sindrom. Međutim, 1997. godine virusi H5N1 izazvali su izuzetno tešku bolest među ljudima u Hong Kongu - od 18 oboljelih, šest je umrlo, svi su se zarazili od pilića. Druga slična epizoda dogodila se u februaru 2003. godine, takođe u Hong Kongu - od pet zaraženih, dvoje je umrlo. H5N1 virusi su periodično izolovani iz pilića i drugih vrsta ptica (uključujući divlje ptice) u lokalnim populacijama.
Fig.2. Shema cirkulacije poznatih podtipova virusa influence A.
Virus serotipa H9N2, koji je rasprostranjen među živinom u Kini i drugim azijskim zemljama, otkriven je kod pet Kineza u avgustu 1998. godine, a godinu dana kasnije u Hong Kongu kod dvije djevojčice oboljele od gripe. Važno je napomenuti da su se svi slučajevi bolesti javljali nezavisno jedan od drugog, a prijenos virusa s osobe na osobu nije uočen. 1996. godine, virus ptičjeg gripa H7N7 izolovan je od žene sa konjuktivitisom. Jedan slučaj u Holandiji završio se smrću. To su samo oni slučajevi koji su službeno zabilježeni, ali u stvarnosti virusi ptičjeg gripa prevazilaze barijeru vrste, očito mnogo češće i počinju zaraziti ne samo ljude, već i druge životinje (svinje, konje, kitove, kune itd.) . Poznati su slučajevi zaraze domaćih ptica (kokoši, ćurki) virusima gripa karakterističnim za divlje ptice, posebno ptica močvarica.
Još uvijek je teško pouzdano procijeniti sve faktore koji ograničavaju raspon domaćina virusa, te mehanizme koji utiču na promjenu domaćina. Takva potraga se provodi, i to već duže vrijeme, u različitim istraživačkim grupama, uključujući i naš institut.
Hemaglutinin je bio prvi na koji se sumnjalo, jer je upravo ovaj glikoprotein odgovoran za prepoznavanje receptora ćelije domaćina i uključen je u fuziju virusne ovojnice sa endosomom (u stvari, dijelom citoplazmatske membrane ćelije domaćina). Struktura ovih receptora se razlikuje u zavisnosti od vrste i tkiva porijekla ćelija. Ove razlike su važne u ograničavanju prijenosa virusa između vrsta i posebno su istražene u vezi s pojavom novih humanih pandemijskih virusa.
Utvrđeno je da receptori epitelnih ćelija ljudskog respiratornog trakta, osim proteina, sadrže i ugljikohidrate - sijalooligosaharide, u kojima je terminalna sijalinska kiselina (N-acetilneuraminska kiselina) vezom 2'-6' povezana sa galaktozom. i ćelijskih receptora
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
crijevni epitel ptica - 2'-3'. Virusi ptičjeg gripa se ne razmnožavaju dobro kod ljudi jer se jednostavno ne mogu vezati za ljudske receptore. Istovremeno, mucini (po prirodi isti kompleksni glikoproteini sa sijaličnom kiselinom na kraju), koji su potrebni za zaštitu ljudskih pluća od mikroorganizama, sadrže receptore sa 2'-3' galaktoznom vezom. Dakle, virus ptičjeg gripa koji slučajno uđe u ljudsko tijelo ne može prodrijeti u ćelije, jer na njihovoj površini nema specifičnih receptora, a mucin blokira prepoznavanje aktivnosti virionskih receptora, pa se čovjek u ovom slučaju suočava samo sa blagim curenje. nos.
Ali u ovom slučaju, kako objasniti pojavu varijanti virusa s promjenom pandemije? Situacija se malo razjasnila kada se saznalo da ćelije respiratornog trakta svinja nose oba tipa receptora i, shodno tome, mogu se zaraziti i virusom ljudske i ptičje gripe. To znači da svinje potencijalno mogu poslužiti kao posredni domaćini za razne viruse i idealna arena za njihovu reasortaciju u mješovitim infekcijama.
Što se tiče hemaglutinina, čini se da je njegova sposobnost prepoznavanja receptora ćelije domaćina prvenstveno povezana sa strukturom mjesta za vezivanje receptora (PCS). Dakle, kod virusa humane gripe PCC sadrži aminokiseline leucin i serin na pozicijama 226 i 228, dok su kod ptičjih virusa te pozicije glutamin i glicin. Druge supstitucije aminokiselina pronađene su u PCC-u kod različitih životinja, što znači da iako je PCC očuvan i evolucijski stabilan, on još uvijek ima promjenjive regije koje utječu na vezivanje receptora (afinitet) i specifičnost.
RCC se može promijeniti nakon što virus savlada barijeru među vrstama, dok virusi ptičje gripe, na primjer, mogu steći sposobnost prepoznavanja receptora ljudskih stanica. Dokaz da se barijera između ptica i ljudi može savladati je izbijanje ljudske gripe u Hong Kongu 1997. godine, uzrokovano ptičjim virusom H5N1.
Pretpostavlja se da je "vezivanje" virusa za domaćina određeno ne samo karakteristikama hemaglutinina, već i drugog površinskog proteina - neuraminidaze. Osim toga, postoje razlozi za vjerovanje da su geni internih i nestrukturnih proteina virusa gripe A uključeni u ograničavanje raspona domaćina. Međutim, prerano je govoriti o tome, jer je još uvijek potrebno proučavati doprinos svaki gen i funkcije njihovih proizvoda. Kako god bilo, važno je shvatiti da čak i minimalne promjene u strukturi virusnih proteina, posebno hemaglutinina, mogu dovesti do značajnih promjena ne samo u rasponu domaćina virusa, već iu stupnju njegove patogenosti (virulencije ).
Virulencija
Podsjetimo da reprodukcija virusa u organizmu domaćina zahtijeva aktivaciju prekursora molekule hemaglutinina; u ovom slučaju, proteaze domaćina ga cijepaju na dvije podjedinice. Proteoliza hemaglutinina niskopatogenih ptičjih virusa javlja se u ograničenom broju tipova ćelija, pa je virus lokalizovan samo u respiratornom ili intestinalnom traktu. To se događa kod asimptomatskih ili umjerenih infekcija. Hemaglutinini visoko patogenih ptičjih virusa razgrađuju se u različitim ćelijama i stoga su sposobni da izazovu smrtonosne sistemske infekcije, posebno kod peradi.
U različitim laboratorijama širom svijeta počeli su proučavati genom sojeva virusa gripe koji su visoko patogeni za ljude (H5N1 i H7N7, izolovani 1997-2004). Pokazalo se da ovi virusi sadrže nekoliko osnovnih aminokiselina na mjestu cijepanja molekule hemaglutinina, što im daje visoku infektivnu aktivnost i patogenost. Za razliku od nepatogenih ili slabo patogenih virusa, koji nemaju ovu sekvencu aminokiselina, hemaglutinin visoko patogenih virusa lako se cijepa ne samo proteazama sličnim tripsinu prisutnim u stanicama ljudskog respiratornog trakta i crijevima ptica, već takođe proteazama sličnim furinu. Djeluju u kombinaciji
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
sa ubikvitinom, dizajniranim da označi proteine za proteaze koje treba uništiti. Proteaze slične furinu se sintetiziraju u različitim tkivima, što patogenim virusima daje mogućnost da inficiraju različite sisteme i organe. Umetanje čak i jedne osnovne aminokiseline na mjesto proteolitičkog cijepanja hemaglutinina dovoljno je da se nisko patogeni virus pretvori u visokopatogen.
Kasnije je to potvrđeno u eksperimentima na miševima zaraženim različitim varijantama (izolovanim u različitim godinama) virusa H5N1. Neki od njih su se počeli razmnožavati u mozgu, jetri, slezeni i krvnim stanicama, uzrokujući 100% smrt miševa sedmog i osmog dana nakon infekcije, dok su se drugi virusi pokazali kao nepatogeni za miševe i razmnožavali su se samo u pluća. Ubrzo je to objašnjeno - u virusima H5N1 izolovanim 2004. godine, u poređenju sa virusima dobijenim 1997-2003, otkrivene su dodatne mutacije gena za hemaglutinin, koje su uticale na promjenu njihovih antigenskih svojstava.
Na patogenost virusa mogu utjecati promjene u strukturi ne samo površinskih, već i unutrašnjih proteina. Na primjer, mutacija na poziciji 627 u proteinu PB2 pronađena je u soju virusa gripe H5N1 koji je visoko patogen za miševe. Upravo je ta mutacija utjecala na razliku u svojstvima dva virusa H5N1 izolirana u Hong Kongu, i kao rezultat toga, rezultat infektivnog procesa. Osim toga, virulentnost ovih virusa gripe povezana je sa strukturnim karakteristikama nestrukturnog NS proteina, posebno sa prisustvom glutaminske kiseline na poziciji 92 u njegovoj molekuli, što viruse čini otpornim na antivirusno djelovanje interferona.
Naravno, korištenjem modernih molekularno-genetičkih metoda u proučavanju virusa gripe postepeno se rasvjetljavaju njihova biološka svojstva, ali ništa manje važne nisu ni tradicionalne metode koje prate cirkulaciju virusa gripe među ljudima, domaćim i divljim životinjama. Predviđanje pojave reasortanata sa tendencijom pandemije i razvoj efikasnih mjera za prevenciju i kontrolu gripe može se razviti samo na osnovu proučavanja ekologije i evolucije uzročnika ove teško predvidljive i teško kontrolirane zarazne bolesti. . Ovakve studije su prije više od 35 godina započeli G. Laver u Australiji, R. Webster u SAD-u, D.K. Lvov u našoj zemlji, a provode se do danas širom svijeta.
Događaji i prognoze
Sveobuhvatnu studiju o virusima influence A pokrenula je Svjetska zdravstvena organizacija (WHO) nakon pandemije izazvane virusom H3N2 1968. godine. Naš institut je otkrio da je progenitor H3N2 bio soj sličan virusu H3N8 izolovanom u Ukrajini 1963. godine od divljih pataka. Ovi i drugi podaci poslužili su kao osnova za razvoj naučnog pravca - ekologija i evolucija virusa gripe A. Stvoren je Nacionalni centar za ekologiju virusa gripe A sa mrežom referentnih baza, gdje su dobijeni novi podaci, potvrđujući odsustvo fundamentalnih razlika između humanog i životinjskog virusa influence A, t.e. prisustvo jednog zaštićenog genskog fonda. Prema tim podacima, 1980. godine stvorena je klasifikacija virusa gripa, bez obzira na njihovo porijeklo. Od tada, svakom izolovanom virusu je dodijeljeno ime koje odražava tip virusa, izvor izolacije, mjesto i godinu izolacije, kao i podtip - na primjer, A / patka / Ukrajina / 63 (H3N8).
Glavni cilj našeg istraživanja u Rusiji bio je proučavanje evolucije virusa gripe A u procesu interakcije virusnih populacija sa populacijama divljih ptica i domaćih životinja i formiranje sojeva sa epidemijskom snagom. Da bi se to postiglo, vrši se monitoring na ključnim tačkama u Sjevernoj Evroaziji; Izolovano je 14 od 16 poznatih virusa
Krajem 2003. godine, tj. tri mjeseca prije početka epidemije izazvane virusom ptičje gripe H5N1 u zemljama jugoistočne Azije, jedan od autora ovog članka (D.K. Lvov) govorio je na međunarodnom kongresu gripe u Japanu, izvještavajući o izolaciji ovih virusa
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
od divljih ptica u Rusiji - na Altaju i na jugu Primorja. Prema molekularno-genetičkim podacima, ovi sojevi su klasifikovani kao nisko patogeni. Tada je, po analogiji sa ranijim zapažanjima, napravljena prva prognoza o mogućnosti njihovog unošenja sa pticama selicama u peradarske farme jugoistočne Azije, gdje bi se nakon nekog vremena mogle pretvoriti u visokopatogene sa panzootskim i pandemijskim potencijalima. Očigledno, to se i dogodilo. Epizootika je za kratko vreme zahvatila 10 zemalja. Od tada je ubijeno i zaklano više od 150 miliona pilića i pataka. Prema podacima SZO, do kraja marta 2006. godine već se zarazilo 185 osoba, od kojih je 104 umrlo. Epizootika se nastavlja, a virusi su prodrli u populacije svinja, što je posebno zabrinjavajuće. Možda je svijet na rubu epidemiološke katastrofe: reasortanti se mogu formirati u bilo kojem trenutku kada su svinje istovremeno zaražene ptičjim virusom H5 i ljudskim virusima H1 ili H3 gripe koji kruže svijetom.
Napravljeno je i drugo predviđanje: u slučaju infekcije divljih ptica visoko patogenim sojevima u zimovališta, povećava se rizik od njihovog unošenja na teritoriju Rusije, posebno u Sibir i Daleki istok, tokom proljetnih migracija. A onda se desilo nešto što je trebalo da se desi. Sredinom jula 2005. godine, u naseljima Novosibirske oblasti, koja se nalaze u jezerskoj severnoj šumskoj stepi nizije Baraba, otkrivena je epizootika među živinom sa stopom mortaliteta od preko 90% i brzim širenjem.
Materijali su prikupljeni od domaćih i divljih ptica koje su živjele u neposrednoj blizini epizootskog lokaliteta. Koristeći SPEV i MDCK ćelijske linije (ova nestandardna metoda se trenutno patentira), izolovali smo šest sojeva H5N1 iz peradi i gnjuraca (Podiceps cristatus), sa vrlo visokom koncentracijom virusa u tkivu. Sa prioritetom od 8. avgusta 2005., ovi sojevi su deponovani u Državnu zbirku virusa, a podaci o sekvenciranju njihovog genoma pune dužine deponovani su u GenBank sa prioritetom 5. septembra 2005. godine. Mjesto proteolitičkog rezanja hemaglutinina svih dobivenih sojeva sadrži aminokiselinsku sekvencu PQGERRRKKRGLF koja je karakteristična za visoko patogene viruse ptičje gripe. Ispostavilo se da su nukleotidne sekvence gena hemaglutinina svih analiziranih virusa peradi potpuno identične, ali se razlikuju od soja izolovanog od divlje ptice (čepasti gnjurac), ali samo po dvije nukleotidne supstitucije (Sl. 3). Filogenetska analiza pokazala je visok nivo homologije hemaglutinina zapadnosibirskih sojeva sa sojevima izolovanim u proleće iste godine iz planinske guske (Anser indicus) na jezeru. Kukunor u sjeverozapadnoj provinciji Qinghai (NRK). To je u potpunosti potvrdila analiza preostalih sedam gena.
Identitet genetskih karakteristika izolovanih sojeva dokazuje direktnu vezu između virusa koji kruže u populacijama divljih i domaćih ptica. Istovremeno, sojevi virusa gripe H5N1 otkriveni 2005. godine značajno se razlikuju od sojeva ovog virusa izolovanog prethodnih godina, uključujući i soj A/Vietnam/1194/2004(H5N1) dobijen iz Engleske, koji se nudi u našoj zemlja za proizvodnju vakcine. Očigledno je da se, barem za veterinarsku vakcinu, može koristiti samo soj iz Državne zbirke virusa, koji po antigenskim svojstvima odgovara virusu koji cirkuliše u Rusiji.
Soj koji smo izolovali, deponovan u Državnu zbirku virusa, već se koristi za masovnu proizvodnju vakcine na peradarskoj farmi Stavropolj. Domaće ptice se vakcinišu u Južnom federalnom okrugu. Do 15. juna 2006. godine planirano je da se proizvede 15 miliona doza vakcine uz dalje širenje proizvodnje.
Inače, u pandemiji, kada je potrebno brzo uspostaviti proizvodnju vakcine, preporučljivo je, po našem mišljenju, koristiti kao supstrat ćelijske linije u kojima se virus gripa brzo akumulira u visokim koncentracijama. Ova novorazvijena metoda ima značajne prednosti u odnosu na tradicionalnu metodu koja se koristi
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
Koriste se pileći embrioni: uz održavanje svih antigenskih domena hemaglutinina, kulturološka vakcina eliminiše pojavu komplikacija povezanih sa pilećim proteinom. Ovo je posebno važno u proizvodnji humanih vakcina. Samo trebate znati koji soj treba koristiti za imunizaciju ljudi. To će ovisiti o antigenskoj karakterizaciji rezultirajuće pandemijske varijante. Možda će biti drugačije od onoga što je sada. U svakom slučaju, upotreba žive vakcine je apsolutno neprihvatljiva. Genetska interakcija između vakcine i terenskih virusa može dovesti do reasortanata s nepredvidivim posljedicama.
Fig.3. Stepen srodnosti nukleotidnih sekvenci gena hemaglutinina varijanti virusa influence A podtip H5 izolovanih od divljih i domaćih ptica u različitim zemljama u posljednjih 10 godina. Visoko patogeni sojevi H5N1 iz grupe virusa Qinghai-Novosibirsk označeni su podebljanim slovima.
Analiza genoma sojeva koje smo izolovali otkrila je niz karakteristika povezanih s biološkim svojstvima. Pored aminokiselinske sekvence proteolitičkog cijepanja hemaglutinina, koja određuje visok nivo patogenosti virusa, pronađene su delecije na poziciji 49-68 u neuraminidazi (genotip Z), što ukazuje na povećan tropizam virusa izolovanih od nas na živinu i potencijalnu patogenost za ljude. Glutaminska kiselina na 92. poziciji proteina NS1 određuje otpornost virusa na djelovanje interferona i povećanu virulentnost za svinje. Lizin na poziciji 627 proteina PB2 objašnjava sposobnost proučavanih sojeva da se razmnožavaju u različitim ćelijskim linijama sisara. Otkrivena svojstva virusa koji je prodro na teritoriju Rusije svjedoče o njegovoj visokoj patogenosti u odnosu na domaće ptice i ljude.
Prisutnost serina, a ne asparagina, na 31. poziciji M2 ukazuje na osjetljivost virusa na rimantadin, što se u potpunosti poklapa s podacima direktnog istraživanja učinka antivirusnih lijekova na reprodukciju virusa. U te svrhe koristili smo i ćelijske linije i ustanovili da su za prevenciju i rano liječenje gripe podjednako efikasni i da se mogu koristiti kao skupi strani lijekovi - na primjer Tamiflu, kao i relativno jeftini domaći koji su dostupni u apoteke - rimantadin,
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
virazol (sa intravenskom i aerosolnom primjenom), arbidol. Nažalost, u zemlji trenutno nema ili je nedovoljna proizvodnja ovih lijekova, te je hitno potrebno stvoriti njihove strateške zalihe.
Kako i kada je visoko patogeni virus gripa H5N1 ušao u Rusiju i kako će se dalje razvijati događaji?
Fig.4. Putevi širenja virusa gripe H5N1 u populacijama divljih i domaćih ptica. Niskopatogeni virusi gripe (LPVV) izolovani iz divljih i domaćih ptica u severoistočnom regionu Altajskog kraja 1991. godine i na jugu Primorskog kraja 2001. su očigledno bili prethodnici izbijanja gripa 1997. u Hong Kongu i epizootijama u jugoistočnoj Aziji. -2005., kao i u sjeverozapadnoj Kini 2005. Postavši visoko patogeni (HPA), ovi virusi su prodrli tokom proljetne migracije divljih ptica u Zapadni Sibir, gdje su u ljeto 2005. godine izazvali izbijanje gripa među živinom. U periodu seobe ptica akvatičnog i poluvodenog kompleksa HPVH se dalje širio na sjever i zapad Evroazije, a u zimu 2006. ovi virusi su već otkriveni u Africi. Debele strelice ukazuju na infekciju virusom gripa iz divljeg doba
ptica domaćim pticama i obrnuto.
Prvo, nisko patogeni sojevi koji kruže u Sibiru i na Dalekom istoku među divljim pticama uvedeni su tokom jesenjih migracija u zemlje jugoistočne Azije (slika 4). Pošto su tamo postale visoko patogene, one su zajedno sa divljim pticama ušle u zapadni Sibir u proljeće 2005. i naglo se intenzivirale u periodu gniježđenja. Visoko patogeni sojevi rasuli su se s pticama do mjesta gniježđenja na površini od više od 10 miliona hektara.
km2. Nakon što je virus pogodio populaciju peradi, dogodila se epizootska eksplozija. Ovo je ozbiljno i dugo.
Treće predviđanje je bilo da će ptice ponovo širiti virus kada u jesen odlete u svoja zimovališta kroz gusto naseljena područja Rusije i drugih zemalja.
BIOLOGIJA I MEDICINSKA NAUKA | Virusi gripa: događaji i prognoze |
I tako se dogodilo. U jesen 2005. virus je već stigao do većine evropskih zemalja, a pronađen je i u Turskoj, na Krimu, u Iranu, Azerbejdžanu, Gruziji, Indiji, ali i u Africi. Stigli smo do Tule, Kalmikije i delte Volge, gdje je u decembru 2005. godine izbila epidemija gripa u populaciji labudova nemih (Cygnusolor) nakon kratkog zaustavljanja letećih sjevernih pataka - pataka s grmovima (Aythya fuligula). Sojevi izolovani od labudova, prema njihovoj molekularno-genetičkoj analizi, takođe pripadaju Qinghai-zapadnosibirskoj grupi virusa. Za pola godine kruženja među divljim pticama, sojevi su zadržali svoj genotip i nisu izgubili visoku patogenost.
Četvrta prognoza je najalarmantnija. Virus je zagadio mnoge rezervoare u gnijezdištima i na migracionim rutama i tu će ostati do proljeća. Svaka prirodna voda u koju je pao izmet zaraženih ptica pretvara se u „tempiranu bombu“. Ovo se može uporediti sa učešćem tresetišta u tajgi požaru. U proleće će se zaražene i zdrave ptice vratiti i proleteti kroz ova "minska polja", pa bi događaji u leto 2006. mogli biti mnogo strašniji nego u protekloj sezoni. To potvrđuje i lavinsko pogoršanje situacije u Evropi, Aziji i Africi već u martu. Ovo je panzootsko. A kada se visokopatogeni sojevi koji kruže među divljim pticama u proljeće vrate u niskopatogene sojeve, nemoguće je predvidjeti koliko će proces njihovog resortiranja trajati mjesecima ili godinama. Jasno je da je to predmet prioritetnog proučavanja, od kojeg zavisi razvoj događaja u doglednoj budućnosti.
Što se tiče pandemijskog virusa, on može nastati i kod nas nakon zaraze svinja virusima ljudi i ptica. Ali najvjerovatnije će nam doći iz Kine, gdje su mogućnosti za transformaciju reasortanta posebno velike s obzirom na aktivnost epizootskog procesa i ogroman osjetljivi kontingent među populacijom. Kod nas se u svakom trenutku može pojaviti pandemijski virus - za to je dovoljna samo jedna aminokiselinska supstitucija u RCC hemaglutinina, kao rezultat toga, virus će početi prepoznavati receptore ljudskih stanica i, shodno tome, početi prenositi od osobe do osobe.
Ono što bi, s naše tačke gledišta, sada trebalo učiniti na državnom nivou, formulirano je u tabeli. Posebnu pažnju posvetit ćemo proučavanju dalje evolucije visoko patogenih sojeva koji su utjecali na populacije divljih ptica. Ključnu ulogu u tome imaju ekosistemi na teritoriji Rusije. Planiramo da nastavimo sa praćenjem u evropskom dijelu zemlje, u Sibiru i na Dalekom istoku, a moguće i u nekim susjednim zemljama.
U posljednjih pet godina, naše istraživanje je provedeno zajedno s lovcima, ornitolozima, zaposlenicima federalnih službi fitoveterinarskog i sanitarno-epidemiološkog nadzora Novosibirske, Astrahanske, Irkutske oblasti, Primorske teritorije, Birobidžana, republika Kalmikije i Burjatije. . Sve se to odvijalo u okviru federalnih programa "Zaštita od patogena", "Razvoj sredstava i metoda za suzbijanje bioterorizma", "Grip A svinja i ptica: interakcija populacija".
