Struktura i kemijski sastav
Virus gripe ima sferni oblik, promjera 80-120 nm. Nitasti oblici su rjeđi. Zavojni nukleokapsid je lanac ribonukleoproteina s dvostrukom spiralom (RNP) koji čini jezgru viriona. S njim su povezane RNA polimeraza i endonukleaze (P1 i P3). Jezgra je okružena membranom koja se sastoji od proteina M, koji povezuje RNP s dvostrukim lipidnim slojem vanjske ljuske i stiloidnim procesima, koji se sastoje od hemaglutinina i neuraminidaze.Virioni sadrže oko 1% RNA, 70% proteina, 24% lipida i 5% ugljikohidrata. Lipidi i ugljikohidrati dio su lipoproteina i glikoproteina vanjske ljuske i staničnog su podrijetla. Genom virusa predstavljen je molekulom RNK fragmentirane minus lanca. Virusi gripe tipovi A i B imaju 8 RNA fragmenata. Od njih 5 kodira po jedan protein, a posljednja 3 kodiraju po dva proteina.Antigeni
Virusi gripe A, B i C međusobno se razlikuju po tipu specifičnom antigenu povezanom s RNP (NP protein) i proteinu M-matriksa koji stabilizira strukturu viriona. Ti se antigeni detektiraju u CSC-ima. Užu specifičnost virusa tipa A određuju još dva površinska antigena - hemaglutinin H i neuraminidaza N, označeni serijskim brojevima. Hemaglutinin je složeni glikoprotein zaštitnih svojstava. Inducira u tijelu stvaranje antitijela koja neutraliziraju viruse - antihemaglutinina, otkrivenih u RTGA. Promjenjivost hemaglutinina (H-antigen) određuje antigenski drift i pomak virusa gripe. Antigenski drift shvaća se kao manje promjene u H-antigenu uzrokovane točkastim mutacijama u genu koji kontrolira njegovo stvaranje. Takve se promjene mogu akumulirati u potomstvu pod utjecajem selektivnih čimbenika poput antitijela. To u konačnici dovodi do kvantitativnog pomaka, izraženog u promjeni antigenskih svojstava hemaglutinina. S antigenskim pomakom dolazi do potpune zamjene gena, koja se može temeljiti na rekombinaciji između dva virusa. To dovodi do promjene podtipa hemaglutinina ili neuraminidaze, a ponekad i oba antigena, te do pojave temeljno novih antigenskih varijanti virusa koje uzrokuju velike epidemije i pandemije.Hemaglutinin je također receptor kojim se virus adsorbira na osjetljivim stanicama. , uključujući eritrocite, uzrokujući njihovo sljepljivanje i sudjeluje u hemolizi eritrocita Virusna neuraminidaza je enzim koji katalizira cijepanje sijalične kiseline iz supstrata. Ima antigena svojstva i istodobno sudjeluje u oslobađanju viriona iz stanice domaćina. Neuraminidaza, poput hemaglutinina, mijenja se kao rezultat antigenskog drifta i pomaka.Uzgoj i razmnožavanje
Virusi gripe uzgajaju se u pilećim embrijima i u staničnim kulturama. Optimalno okruženje su pileći embriji u čijim se amnionskim i alantoičnim šupljinama virus razmnožava 36-48 sati.Najosjetljivije na virus gripe su primarne kulture bubrežnih stanica ljudskog embrija i nekih životinja. Reprodukcija virusa u tim kulturama popraćena je blagim CPP, nalik spontanoj degeneraciji stanica. Virusi gripe se adsorbiraju na glikoproteinskim receptorima epitelnih stanica, u koje prodiru endocitozom receptora. Transkripcija i replikacija virusnog genoma odvija se u jezgri stanice. U tom slučaju, pročitani pojedinačni fragmenti RNA u obliku mRNA se prevode u ribosome, gdje se sintetiziraju proteini specifični za virus. Nakon replikacije virusnog genoma formira se skup virusne RNA koja se koristi u sastavljanju novih nukleokapsida.Patogeneza
Primarna reprodukcija virusa događa se u epitelnim stanicama respiratornog trakta. Kroz erodiranu površinu sluznice virus ulazi u krvotok, uzrokujući viremiju. Cirkulacija virusa u krvi popraćena je oštećenjem endotelnih stanica krvnih kapilara, što rezultira povećanjem njihove propusnosti. U teškim slučajevima uočavaju se krvarenja u plućima, srčanom mišiću i drugim unutarnjim organima. Virusi gripe, ulazeći u limfne čvorove, oštećuju limfocite, što rezultira stečenom imunodeficijencijom, što doprinosi nastanku sekundarnih bakterijskih infekcija.Gripa uzrokuje intoksikaciju tijela različite težine.Imunitet
Mehanizam imunosti protiv gripe povezan je s prirodnim čimbenicima antivirusne nespecifične zaštite, uglavnom s proizvodnjom interferona i prirodnih stanica ubojica, a specifičnu imunost osiguravaju stanični i humoralni čimbenici odgovora. Prve predstavljaju makrofagi i T-ubojice. Potonji su imunoglobulini, prvenstveno antihemaglutinini i antineurominidazna antitijela, koja imaju svojstva neutraliziranja virusa. Potonji, za razliku od antihemaglutinina, samo djelomično neutraliziraju virus gripe, sprječavajući njegovo širenje. Antitijela za fiksiranje komplementa na virusni nukleoprotein nemaju zaštitna svojstva i nakon 1,5 mjeseca. nestaju iz krvi rekonvalescenata.Protutijela se nalaze u krvnom serumu 3-4 dana nakon pojave bolesti i dostižu maksimalne titre nakon 2-3 tjedna. Trajanje specifičnog imuniteta stečenog nakon infekcije gripom, suprotno dosadašnjim idejama, mjeri se u nekoliko desetljeća. Do ovog zaključka došlo se na temelju proučavanja dobne strukture incidencije gripe uzrokovane virusom A (H1N1) 1977. godine. Utvrđeno je da je ovaj virus, koji je izostao od 1957., 1977. oboljevao samo osobe koje nisu stariji od 20 godina. Dakle, nakon preležane infekcije gripe uzrokovane virusom gripe tipa A, formira se intenzivan imunitet, striktno specifičan za podtip virusa (po H- i N-antigenima) koji je uzrokovao njegovo stvaranje. Osim toga, novorođenčad imaju pasivnu imunost zbog antitijela klase IgG na odgovarajući podtip virusa A. Imunitet traje 6-8 mjeseci.Epidemiologija
Izvor infekcije su bolesni ljudi i nositelji virusa. Prijenos patogena događa se kapljicama u zraku. Gripa se odnosi na epidemijske infekcije koje se često javljaju u zimskim i zimsko-proljetnim mjesecima. Otprilike svakih deset godina, epidemije gripe poprimaju oblik pandemije, pokrivajući stanovništvo različitih kontinenata. To je zbog promjene u H- i N-antigenima virusa tipa A povezane s antigenskim pomakom i pomakom. Na primjer, virus gripe A s hemaglutininom NSW1 izazvao je pandemiju španjolske gripe 1918. godine, koja je odnijela 20 milijuna ljudskih života. Godine 1957. virus "azijske" gripe (H2N2) izazvao je pandemiju koja je zahvatila više od 2 milijarde ljudi. Godine 1968. pojavila se nova pandemijska varijanta, virus gripe A (H3N2), nazvan "Hong Kong virus", koji cirkulira do danas. Godine 1977. pridružio joj se virus tipa A (H1N1) To je bilo neočekivano, budući da je identičan virus cirkulirao već 1947.-1957., a potom je potpuno zamijenjen "azijskim" podtipom. S tim u vezi, pojavila se hipoteza da varijante pomaka virusa nisu povijesno nove. Radi se o serosubtipovima koji cirkuliraju proteklih godina.Prestanak cirkulacije virusa gripe koji je izazvao još jednu epidemiju objašnjava se kolektivnim imunitetom populacije koja se razvila na ovu antigenu varijantu uzročnika. U tom kontekstu dolazi do odabira novih antigenskih varijanti na koje još nije formiran kolektivni imunitet.Još nije jasno gdje su se pomaknule antigenske varijante (seropodtipovi) virusa gripe tipa A koje su napustile aktivnu cirkulaciju u određenom povijesnom razdoblju. čuvaju se dugo vremena. Moguće je da su rezervoar takvih virusa divlje i domaće životinje, posebice ptice, koje su zaražene ljudskim varijantama virusa gripe A i dugo ih održavaju u cirkulaciji. Istodobno se u tijelu ptica događaju genetske rekombinacije između ptičjih i ljudskih virusa koje dovode do stvaranja novih antigenskih varijanti.Prema drugoj hipotezi, virusi gripe svih poznatih podtipova neprestano kruže među populacijom, ali postaju epidemijski relevantni. samo uz smanjenje kolektivnog imuniteta.Virusi gripe tipova B i C imaju veću antigensku stabilnost. Virusi gripe tipa B uzrokuju manje intenzivne epidemije i lokalizirane epidemije. Uzročnik sporadičnih bolesti je virus gripe tipa C. Virus gripe brzo se uništava temperaturama iznad 56°C, UV zračenjem, dezinficijensima, deterdžentima. Zadržava svoju održivost 1 dan. na sobnoj temperaturi, na glatkim metalnim i plastičnim površinama - do 2 dana. Virusi gripe preživljavaju na niskim temperaturama (-70°C).Specifična profilaksa
Za prevenciju gripe koristi se rimantadin koji suzbija reprodukciju virusa gripe tipa A. Za pasivnu profilaksu koristi se humani antiinfluenca imunoglobulin dobiven iz krvnog seruma darivatelja imuniziranih cjepivom protiv gripe. Određeni učinak ima humani leukocitni interferon.Za cijepljenje se koriste živa i inaktivirana cjepiva. Uvođenjem živih cjepiva formira se opći i lokalni imunitet. Osim toga, primjećuje se indukcija interferona.Trenutno su dobivena inaktivirana cjepiva različitih tipova: virion, podjedinica, podijeljena i miješana. Virion cjepiva dobivaju se visokokvalitetnim pročišćavanjem virusa uzgojenih u pilećim embrijima. Podjedinična cjepiva su pročišćeni površinski antigeni virusa gripe - hemaglutinini i neuraminidaza. Takve pripravke cjepiva karakterizira niska reaktogenost i visoka imunogenost. Odcijepljena ili dezintegrirana cjepiva dobivaju se iz pročišćene suspenzije viriona tretiranjem deterdžentima. Međutim, još uvijek nema konsenzusa o prednostima bilo kojeg od ovih cjepiva. Inaktivirana cjepiva izazivaju imunološki odgovor u sustavu opće i lokalne humoralne imunosti, ali u manjoj mjeri od živih cjepiva induciraju sintezu interferona.Dugogodišnje iskustvo u primjeni živih i inaktiviranih cjepiva ukazuje na antigensku nepodudarnost cjepivih sojeva. kod epidemijskih sojeva je glavni, ali ne i jedini razlog niska učinkovitost cijepljenja protiv gripe. Posljednjih godina pokušavaju se stvoriti genetski modificirana i sintetička cjepiva protiv gripe.gripe
Gripa je akutna ljudska respiratorna bolest koja se širi epidemijski. Karakterizira ga kataralna upala gornjih dišnih puteva, groznica, teška opća opijenost. Gripu često prati pojava teških komplikacija – sekundarna bakterijska upala pluća, pogoršanje kroničnih plućnih bolesti.. Uzročnici gripe pripadaju obitelji Orthomyxoviridae. Uključuje tri roda virusa - A, B, C. Virus gripe ima sferni oblik, njegove dimenzije su 80-120 nm. Ponekad nastaju filamentozni virioni. Genom tvori jednolančani negativni lanac RNK, koji se sastoji od osam fragmenata, a okružen je proteinskim kapsidom. RNA povezana s 4 unutarnja proteina: nukleoproteini (NP) i proteini visoke molekularne težine PI, P2, P3 uključeni u transkripciju genoma i replikaciju virusa. Nukleokapsid ima spiralnu simetriju. Iznad kapsidne membrane nalazi se sloj matriksnog proteina (M protein). Na vanjskoj, superkapsidnoj membrani, hemaglutinin (H) i neuraminidaza (N) nalaze se u obliku bodlji. Oba glikoproteina (N i H) imaju izražena antigena svojstva. U virusima gripe pronađeno je 13 različitih antigenskih tipova hemaglutinina (NI-13) i 10 varijanti neuraminidaze (N1-10) Prema unutarnjem nukleoproteinskom antigenu razlikuju se tri tipa virusa gripe - A, B, C, koji može se odrediti u RSK. Virusi tipa A koji inficiraju ljude imaju tri tipa hemaglutinina (HI, H2, H3) i dvije vrste neuraminidaze (N1, N2). Ovisno o njihovim kombinacijama, postoje varijante virusa gripe A - H1N1, H2N2, H3N2. određuju se u reakciji inhibicije hemaglutinacije s odgovarajućim serumima.Virusi gripe lako se uzgajaju u pilećim embrijima i raznim kulturama stanica. Maksimalno nakupljanje virusa događa se nakon 2-3 dana. U vanjskom okruženju virus brzo gubi svoju infektivnost sušenjem. Na niskoj temperaturi u hladnjaku čuva se tjedan dana, na -70 ° C - puno dulje. Zagrijavanje dovodi do njegove inaktivacije nakon nekoliko minuta. Pod utjecajem etera, fenola, formalin brzo propada.Virološka dijagnostička metoda
Kao materijal za istraživanje korišteni su nazofaringealni brisevi, iscjedak iz nosa uzet suhim ili mokrim sterilnim vatama u prvim danima bolesti, sputum. Virusi se mogu naći u krvi, cerebrospinalnoj tekućini. U smrtonosnim slučajevima uzimaju se komadići zahvaćenih tkiva gornjih i donjih dišnih puteva, mozga i dr. Brisevi nazofarinksa uzimaju se natašte. Bolesnik treba tri puta isprati grlo sterilnom fiziološkom otopinom natrijevog klorida (10-15 ml), koja se skuplja u sterilnu staklenku sa širokim grlom. Nakon toga se komadom sterilne vate obriše stražnja stijenka ždrijela, nosni prolazi, zatim se umoči u staklenku s ispiranjem.Možete uzeti materijal sterilnim štapićem navlaženim u otopini natrijevog klorida, koji se pažljivo obrisan stražnjim zidom grla. Nakon uzimanja materijala, bris se uroni u epruvetu s fiziološkom otopinom u koju se doda 5% inaktiviranog životinjskog seruma. U laboratoriju se brisevi ispiru u tekućini, stisnu uz stijenku epruvete i vade. Odvod se drži u hladnjaku da se taloži, a zatim se srednji dio tekućine unese u sterilne epruvete. Antibiotici penicilin (200-1000 jedinica/ml), streptomicin (200-500 μg/ml), nistatin (100-1000 jedinica/ml) se dodaju u materijal za uništavanje prateće mikroflore, drže 30 minuta na sobnoj temperaturi i koriste izolirati viruse, prethodno provjerivši sterilnost.Osjetljiva metoda za izolaciju virusa koji inficiraju kokošije embrije stare 10-11 dana. Materijal u volumenu od 0,1-0,2 ml ubrizgava se u amnionsku ili alantoisnu šupljinu. Zaraziti, u pravilu, 3-5 embrija. Embriji se inkubiraju na optimalnoj temperaturi od 33-34°C 72 sata. Kako bi se povećao broj viriona u ispitivanom materijalu, on je prethodno koncentriran. Da biste to učinili, koristite metode adsorpcije virusa na pilećim eritrocitima, tretman s 0,2% otopinom tripsina za poboljšanje infektivnih svojstava virusa ili ih precipitirajte posebnim metodama. Nakon inkubacije, pileći embriji se hlade na temperaturi od 4 ° C tijekom 2-4 sata, a zatim aspiriran sterilnim pipetama ili štrcaljkom alantoisnu ili amnionsku tekućinu. Pri tome se uz pomoć RHA utvrđuje prisutnost zaraznog virusa. Da biste to učinili, pomiješajte jednake količine (0,2 ml) virusnog materijala i 1% suspenzije pilećih eritrocita. Pozitivna reakcija (prisutnost virusa u materijalu) dokazuje se taloženjem eritrocita u obliku kišobrana.Ako u materijalu postoji virus koji ima svojstva hemaglutinacije, titrira se ekspandiranim RGA, pri čemu se određuje titar hemaglutinacijske aktivnosti. Pomoću te reakcije određuje se titar virusa hemaglutinacije – najveće razrjeđenje materijala, koje još uvijek daje reakciju hemaglutinacije. Ova količina virusa uzima se kao jedna hemaglutinacijska jedinica (HAU).Identifikacija virusa gripe pomoću RTGA
Da biste to učinili, prvo pripremite radno razrjeđenje virusnog materijala, koji sadrži 4 GAO virusa u određenom volumenu.Obračun reakcije provodi se nakon formiranja sedimenta eritrocita u kontrolnim jažicama. O pozitivnoj reakciji svjedoči kašnjenje hemaglutinacije u ispitnim jažicama.Virusi gripe mogu se izolirati korištenjem različitih linija staničnih kultura - ljudski embrij, majmunski bubreg, kontinuirana stanična linija bubrega psa (MDCK) i druge. U staničnim kulturama očituje se citopatsko djelovanje virusa (pojava stanica sa zaobljenim rubovima, vakuola, stvaranje intranuklearnih i citoplazmatskih inkluzija) što završava degeneracijom staničnog monosloja. 1:8). Uz ovu reakciju mogu se koristiti i RGGads, međutim, manje su osjetljivi i zahtijevaju titar imunološkog seruma od najmanje 1:160, kao i RSK, RN, PEMA itd.Serološka studija
Za potvrdu dijagnoze gripe koristi se serološki test. Temelji se na određivanju četverostrukog povećanja titra antitijela u serumu bolesnika.Prvi serum dobiva se na početku bolesti u akutnom razdoblju (2-5-1 dana bolesti), drugi - nakon 10-14. dan bolesti. Budući da se serumi mogu konzumirati istovremeno, prvi od njih se čuva u hladnjaku na temperaturi od -20°C. Najčešće se koriste RTGA, RSK, RNGA. Te se reakcije postavljaju posebnim setovima standardnih virusnih dijagnostičkih kompleta (referentni sojevi virusa gripe različitih seroloških tipova). Budući da serumi pacijenata mogu sadržavati nespecifične inhibitore hemaglutinacije, prvo se zagrijavaju na temperaturi od 56 °C, a također se tretiraju posebnim enzimom (na primjer, neuraminidazom) ili otopinama kalijevog perjodata, rivanola, mangan klorida, bijeli ovjes za gume itd. prema posebnim shemama. IReakcija inhibicije hemaglutinacije
Reakcija inhibicije hemaglutinacije može se staviti u epruvete (macroshtod) ili u posebne ploče za imunološka ispitivanja.Reakcija se smatra pozitivnom kada se formira kompaktan, gusti sediment eritrocita glatkih rubova.Ekspresna dijagnostika
Metoda se temelji na detekciji specifičnih virusnih antigena u ispitivanom materijalu primjenom imunofluorescencije u izravnom ili neizravnom RIF-u. Sluz se dobiva iz nosnih prolaza ili stražnje stijenke ždrijela, centrifugira, a iz sedimenta stanica cilindričnog epitela sluznice na stakalcima se pripremaju brisevi. tretiraju se imunofluorescentnim serumima konjugiranim na fluorokrome, kao što je FITC (fluorescein izotiocijanat). Prilikom pregleda preparata pomoću luminiscentnog mikroskopa uočava se karakterističan zeleno-žuti sjaj virusa gripe koji se na početku bolesti lokaliziraju u jezgri epitelnih stanica.U posljednje vrijeme se predlaže primjena ELISA, RZNGA i PCR za označavanje specifičnih virusnih antigena.Epidemiološka sezona 2017-2018 je na putu. Cijepitelji pripremaju šprice, terapeuti pripremaju fonendoskope, farmaceuti se opskrbljuju “lijekovima protiv gripe”, a stanovništvo čita medijske izvještaje i nada se da će preživjeti još jedan sezonski virusni napad s minimalnim gubicima. Tijekom godina aktivnog razvoja informacijskog prostora građani su se već navikli na misteriozne nazive H1N1 ili H5N1, a neki već znaju da je prvi svinjska, a drugi ptičja gripa. No, do sada, malo tko od običnih pacijenata - bivših i budućih - razumije kako virus gripe djeluje i kako točno djeluje. MedAboutMe će popuniti ovu prazninu.
Kako je organiziran virus gripe?
Virusi gripe pripadaju zasebnoj obitelji ortomiksovirusa. Njihov genom ne sadrži dvolančanu DNK, kao kod ljudi, već jednolančanu RNA. Štoviše, ovaj se lanac sastoji od 8 zasebnih fragmenata koji kodiraju općenito samo 11 proteina. Fragmenti RNA se čak i repliciraju, odnosno umnožavaju neovisno jedan o drugom. Ovo je važna točka koja objašnjava zašto se virusi gripe tako lako mijenjaju i stvaraju nove sorte. Ako dva različita soja virusa gripe prodru u jednu stanicu, tada mogu razmjenjivati odvojene dijelove genoma, stvarajući tako nove, ranije nepostojeće reasortantne viruse.
Oblik virusa je kugla. U samom srcu ove sfere nalaze se fragmenti RNA lanca, od kojih je svaki povezan sa skupom proteina odgovornih za replikaciju tog određenog fragmenta genoma, odnosno predstavljaju 8 nukleoproteina. Svi ovi nukleoproteini pakirani su u nukleokapsid, nježno uvrnutu proteinsku ljusku. A na vrhu - a to je posebnost takozvanih virusa s omotačem - nalazi se još jedan premaz, koji se zove superkapsid.
Superkapsid je iznimno važna formacija za virus gripe. Zapravo, ovo je lipidna dvoslojna membrana, koja uključuje nekoliko vrsta glikoproteina - kompleksa proteina i ugljikohidrata. Upravo pomoću glikoproteina znanstvenici određuju kakav je soj virusa gripe ušao u njihovu epruvetu. Zahvaljujući tim spojevima virus ulazi u stanicu i razmnožava se. I, konačno, neki učinkoviti lijekovi protiv gripe usmjereni su na kontakt s glikoproteinima.
Koji se jedinstveni spojevi mogu naći na površini superkapsida virusa gripe?
- hemaglutinin.
Ovo je spoj s kojim virus, prvo, prepoznaje receptore stanica organizma domaćina, a drugo, veže se na njih. Protutijela na hemaglutinin nastaju kada se osoba razboli od određenog soja virusa gripe i pruža buduću zaštitu od njega. Postoji 16 podtipova hemaglutinina.
- Neuraminidaza.
Riječ je o enzimu koji, prije svega, uništava komponente zaštitnog sloja sluzi na sluznicama dišnog trakta i time olakšava prolaz virusa do ciljane stanice. Drugo, neuraminidaza je uključena u fuziju virusne čestice sa stanicom. Konačno, osigurava oslobađanje novih virusnih čestica iz zaražene stanice. Da nema neuraminidaze, tada bi ciklus reprodukcije bio ograničen na samo jednu stanicu, čak i bez ikakvih simptoma bolesti. Protutijela na neuraminidazu nastaju u našem tijelu kao rezultat cijepljenja – ne dopuštaju širenje virusa gripe po cijelom tijelu. Postoji 9 podtipova neuraminidaze u virusima gripe A i po jedan u virusima gripe B i C.
- M2 protein.
To je takozvani ionski kanal, odnosno podesiva “rupa” u membrani virusa kroz koju se ioni mogu kretati. Budući da govorimo o ionima, to znači da govorimo o nabojima koje oni nose, odnosno, kada ionski kanal radi, pH unutar virusne čestice će se promijeniti. M2-protein je namijenjen za prijenos protona, odnosno jezgri atoma vodika koje imaju pozitivan naboj (H+).
Dakle, virus gripe se uz pomoć neuraminidaze probio kroz sloj sluzi u dišnim putevima i dospio na površinu epitelne stanice, točnije, do trepljastog epitela koji ih oblaže. Neuraminidaza ima poseban "džep" kojim se veže za male ostatke ugljikohidrata koji strše iz stanične membrane (oligosaharide). U tom slučaju superkapsid virusa dolazi u dodir sa staničnom membranom i njihovi se lipidni slojevi spajaju. Kao rezultat toga, nukleokapsid, koji sadrži, kao što se sjećamo, 8 segmenata RNA, ulazi u stanicu, u njezinu citoplazmu.
Dok je u tijeku proces prodiranja nukleokapsida virusa u stanicu, protein M2 aktivno radi. On pumpa protone u virus, što znači da okoliš unutar njega postaje sve kiseliji. Kao rezultat ovih manipulacija, sadržaj nukleokapsida prodire u staničnu jezgru. Istodobno se oslobađaju segmenti virusne RNA u obliku kompleksa s proteinima, koji dobivaju sve potrebne resurse stanice na raspolaganju i započinju proizvodnju novih virusa. Ovo je također vrlo promišljen proces, tijekom kojeg se formiraju "privremene" mRNA, ostavljajući jezgru citoplazmi da tamo organizira sintezu virusnih proteina. Zatim se ti proteini transportiraju u jezgru, gdje se, konačno, odvija sastavljanje virusnih čestica. Dio nove genomske RNA koristi se za dodatnu replikaciju genoma virusa.
Može se samo diviti točnosti sastavljanja 8 različitih segmenata virusne RNA u jednu buduću virusnu česticu. Nemoguće je da dva identična segmenta uđu u isti nukleokapsid, a mehanizam tog procesa još je nepoznat. U ovom trenutku može doći do stvaranja reasortantnih virusa, o čemu smo gore govorili. Konačno, gotovi nukleokapsidi prelaze u citoplazmu. Prilikom prolaska kroz staničnu membranu, svježe sastavljeni nukleokapsid dobiva superkapsidnu ljusku s cijelim skupom glikoproteina.
Cijeli ciklus od prodora virusa u stanicu do oslobađanja novih virusnih čestica iz nje traje od 6 do 8 sati. Brojni virusi izlaze van i inficiraju susjedne stanice. Rjeđe, virioni ulaze u krvotok i šire se po cijelom tijelu. Širenje virusa kroz tkiva i organe naziva se viremija. Vrhunac replikacije virusa gripe opaža se u intervalu od 24 do 72 sata od trenutka kada virusne čestice uđu u epitel respiratornog trakta.
Kada se oslobode novi virioni, stanice u kojima su se razmnožili umiru. Izbija upalni proces. Stoga su kod gripe prvenstveno zahvaćeni gornji dišni putovi, postupno upala pokriva dušnik i bronhije. Ako virusi uđu u krvotok i šire se po cijelom tijelu, infekcija postaje generalizirana, razvija se intoksikacija tijela.
Opasnost od gripe leži u činjenici da zahvaća krvne žile i živčani sustav. U pozadini zaraze virusom gripe dolazi do masovnog stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), odnosno slobodnih radikala koji imaju tendenciju oksidirati sve što im se nađe na putu.
Treba razumjeti da sam virus gripe ne sadrži toksine. Toksičan učinak imaju spojevi koje naše tijelo proizvodi u pokušaju da se zaštiti od virusa. Ova reakcija je toliko nasilna, a mjesto za unošenje virusa odabrano je tako "uspješno" da osoba pati od vlastitog imunološkog sustava. Prema istraživanjima, ROS pokreću procese proteolize - uništavanja proteina. To se događa u dišnim putovima na granici sa zrakom, što rezultira "respiratornim" ili "metaboličkim" eksplozijom.
Budući da se proces unošenja i razmnožavanja virusa odvija u respiratornom traktu, prije svega pate stijenke tamo smještenih kapilara (male krvne žile). Postaju krhkiji, propusniji, što u teškim slučajevima dovodi do poremećaja lokalne cirkulacije, razvoja hemoragijskog sindroma i prijetnje plućnog edema. U pozadini oštećenja krvožilnog sustava, opskrba krvlju mozga može se pogoršati i kao rezultat toga nastaje neurotoksični sindrom.
Imunološki sustav u ovom trenutku aktivira proizvodnju ogromne količine citokina - tvari koje pokreću upalne reakcije i imaju citotoksični učinak. Obično bi se trebali baviti inaktivacijom i eliminacijom zaraznih uzročnika. Ali opseg procesa je toliko velik da se razvija sistemski upalni odgovor.
Kao rezultat toga, zbog oštećenja sluznice dišnog trakta i krvnih žila, smanjuje se sposobnost imunološkog sustava da izdrži vanjske prijetnje, a smanjuje se aktivnost zaštitnih krvnih stanica neutrofila. Općenito, to dovodi do aktivacije postojećih kroničnih bolesti i povećava rizik od bakterijske infekcije. Najteža i najčešća komplikacija gripe je upala pluća.
Različiti sojevi gripe razlikuju se jedni od drugih, posebice po sposobnosti aktiviranja masovne proizvodnje ROS-a. Stoga su neke vrste gripe teže, dok su druge lakše. U velikoj mjeri ulogu igra stanje tijela pacijenta, njegov imunološki status, iskustvo poznanstva s drugim sojevima. Neke vrste gripe su opasnije za starije osobe i djecu, dok druge češće pogađaju populaciju u najboljim godinama.
Kako bi se zaustavio proces umnožavanja virusa u stanicama i njegovo širenje po tijelu, potrebne su tvari koje mogu prekinuti njegov ciklus reprodukcije, izbrušen evolucijom.
Godine 1961. znanstvenici su predložili borbu protiv virusa gripe amantadinom. Ovaj spoj je odobren za upotrebu 1966. godine, a 1993. godine pojavio se rimantadin, njegov analog. Amantadin (i rimantadin) mogu blokirati ionske kanale M2 proteina. To zaustavlja replikaciju virusa u početnim fazama.
Lijek je bio vrlo učinkovit protiv virusa skupine A, ali nije djelovao na viruse skupine B i C. A 2006. godine američki Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) objavili su podatke o iznimno visokoj rezistenciji (otpornosti) nekih sojeva virusa na adamantane, dosežući i do 90%. Uzrok su bile točkaste mutacije u genomu virusa koje su se pojavile tijekom liječenja adamantanima. Dakle, danas se rimantadin i njegovi drugi analozi smatraju neučinkovitim lijekovima. Štoviše, u početku su bili beskorisni protiv virusa skupina B i C.
Godine 1983. razvijeni su inhibitori neuraminidaze - tvari koje blokiraju sposobnost enzima da potakne oslobađanje novih viriona iz inficirane stanice. To vam omogućuje da zaustavite replikaciju i širenje virusa.
Inhibitori neuraminidaze uključuju oseltamivir (Tamiflu) i zanamivir (Relenza). Od 2009. još jedan intravenski lijek iz ove skupine, paramivir, odobren je za uporabu u Sjedinjenim Državama. Ovi lijekovi su, zapravo, jedini lijekovi dizajnirani posebno za borbu protiv virusa gripe. Ali treba ih uzeti u roku od 24-48 sati od trenutka prvih manifestacija bolesti. Kasnije će biti neučinkoviti - brojni novi virusi već će se proširiti po cijelom tijelu.
Sva druga takozvana antivirusna sredstva nemaju utjecaja na sam virus gripe niti na pojedine faze njegova prodiranja u organizam, razmnožavanja i širenja.
- Virus gripe je konstrukt koji je priroda osmislila da prodire u tijelo kroz respiratorni trakt i opremljen svim potrebnim "glavnim ključevima" za to.
- Postoji samo nekoliko vrsta lijekova koji djeluju specifično na virus gripe, uzimajući u obzir karakteristike njegovog životnog ciklusa i strukture. Ali jedan od tih lijekova već je neučinkovit, jer mu se virus prilagodio. I druge vrste lijekova djelotvorne su samo vrlo kratko nakon pojave prvih simptoma. Učinak drugih lijekova protiv gripe nije dokazan.
- Stoga se za liječenje gripe koristi simptomatska terapija i praćenje stanja bolesnika. U većini slučajeva kod gripe je dovoljno jednostavno ležati kod kuće, uzimati lijekove za smanjenje visoke temperature ako je narasla na 39°C i druga sredstva za ublažavanje stanja bolesnika. Važno je spriječiti razvoj komplikacija - za to samo trebate stvoriti sve uvjete da se tijelo bori protiv virusa.
- Cijepljenje je i dalje najbolji način borbe protiv virusa. Čak i ako je osoba cijepljena protiv jednog soja, a zaražena drugom, postojeća antitijela mogu pružiti barem minimalnu zaštitu i olakšati tijek bolesti.
Preuzmite aplikaciju za gripu i cijepljenje
K. SCHOLTISSEK i H.-D. KLENK (CH. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK)
I. UVOD
Postoji niz recenzija o problemu replikacije virusa gripe. Literatura prije 1968. sažeta je u Hoyle (1968.) i Scholtissek (1969.); noviji pregledi su White (1973.) i Compans i Choppin (1974.).
Većina podataka o replikaciji dobivena je proučavanjem virusa gripe tipa A. Značajne razlike u (Mehanizmi replikacije drugih tipova virusa gripe još nisu pronađeni.
Nekoliko sustava staničnih kultura prikladnih za proučavanje replikacije postalo je popularno, kao što je razmnožavanje WSN soja virusa gripe u MDBK stanicama (Choppin, 1969.) ili razmnožavanje virusa ptičje kuge (FPV) u stanicama fibroblasta pilećih embrija. Primjer krivulje rasta posljednjeg virusa u jednom ciklusu dokazan je na 30, gdje je razdoblje latencije otprilike 3 sata, a proizvodnja virusa doseže plato između 8 i 12 sati infekcije. Stoga su takvi sustavi vrlo prikladni za biokemijske studije.
II. ADSORPCIJA, PENETRACIJA, "PRUGANJE" VIRUSA
Infekcija stanice virusom počinje adsorpcijom, tj. pričvršćivanjem virusne čestice na površinu stanice. Vezanje zahtijeva dvije komplementarne strukture, a to su: receptorska mjesta na površini stanice i virusna komponenta odgovorna za prepoznavanje tih receptorskih mjesta. Sposobnost virusa gripe da stupi u interakciju s eritrocitima različitog porijekla i da ih aglutinira poznata je već dugi niz godina (Hirst, 1941.; McClelland, Hare, 1941.) Hemaglutinacija je korištena kao model odgovora za interakciju virusa gripe sa površinom stanice, a "većina vašeg znanja o ovom fenomenu potječe iz takvih studija. Međutim, treba biti vrlo oprezan u generalizacijama, jer strukture površine eritrocita i površine inficiranih stanica mogu biti potpuno različite (vidi također 3. poglavlje).
A. ULOGA HEMAGGLUTININA U ADSORPCIJI
Komponenta viriona uključena u vezanje je HA* šiljak. Uloga virusnih β-proteina u inicijaciji infekcije proučavana je korištenjem antitijela specifičnih za dva površinska proteina: HA* i NA*. Ta se antitijela mogu dobiti pomoću rekombinantnih virusa. Na primjer, križanjem između AO i A2 virusa nastaje rekombinant X7F1, koji nosi HA*, AO i NA* A2 (Kilbourne i sur., 1968.). Antiserum protiv virusa X7F1 ne inhibira NA* virusa gripe tipa AO, ali inhibira hemaglutinaciju i neutralizira infektivnost ovog tipa virusa. Interakcija istog seruma s A2 virusima gripe ne inhibira hemaglutinaciju ili infektivnost, iako je neutralizacija aktivnosti NA* potpuna. Dakle, NA* nije uključen u proces iniciranja infekcije, a čini se da je samo NA* odgovoran za adsorpciju. Ovaj koncept je podržan dokazima da su virusne čestice iz kojih su proteolitičkim enzimima uklonjene samo šiljci neuraminidaze ostale infektivne (Schulze, 1970.).
Postoje dokazi da je hemaglutinirajući dio lokaliziran na vanjskom dijelu "šiljaka" HA*, bogatog ugljikohidratima (vidi Poglavlje 3). Čini se da su ugljikohidrati bitni za funkcioniranje HA*, budući da se neglikozilirani proteini HA* ne mogu vezati za eritrocite (Klenk i sur., 1972b).
B. RECEPTOR VIRUSA INFLUENCE
Ugljikohidrati su esencijalni (komponenta ne samo hemaglutišina, već i virusnog receptora na površini stanice. Hirst (1942) je primijetio da je kompleks virus-eritrocit nestabilan i da je receptor na površini stanice uništen enzimom Kao što je kasnije pokazano, ovaj enzim je neuraminidaza, koja cijepa neurašinsku kiselinu od glikoproteina (Klenk i sur., 1955; Klenk, Stoffel, 1956; Gottschalk, 1957). Ovo je bila prva demonstracija enzima koji je sastavni dio virusne čestice, 1947. Tako je otkriveno da je receptor za virus gripe glikoprotein koji sadrži neuraminsku kiselinu.
Od tada se nakupilo mnogo informacija
o receptoru miksovirusa, sažeto nedavno u pregledu
Hughes (1973). Ukratko, dobiveni podaci svode se na sljedeće
puhanje. Receptorska mjesta sadrže ostatke neuromio-
joične kiseline, koje su prisutne u lancima ugljikohidrata
glikoproteini. Neoksidirajući terminalni ostaci neurama
noznla neophodni su za interakciju glikoproteina s vi
virus gripe. Liječenje neuraminidazom potpuno uklanja
aktivnost vezanja. Studije degradacije sa
koristeći periodat sugeriraju da za povezivanje
aktivnost zahtijeva netaknutu neuraminsku molekulu
kiseline (Suttajit i Winzler, 1971). karboksilna skupina,
vjerojatno također igra važnu ulogu, budući da je potrebno,
očito i elektrostatičke sile (Huang, 1974).
Čini se vjerojatnim da postoji samo slab specijal
značajka u odnosu na strukturu s kojom je povezana
neuraminsku kiselinu, budući da je, kako se pokazalo, cjelina
skup glikoproteina koji sadrži yairaminsku kiselinu,
povezane s miksovirusima. Štoviše, gangliozidi (gli-
aktivni su u tom pogledu (Haywood, 1975.).
Za nadati se da će pitanje vezanja virusa gripe postati jasnije nakon što se utvrdi molekularna struktura receptora. Donekle je to već postignuto u slučaju eritrocita (Marchesi i sur., 1973.). Dodatne informacije također se mogu pružiti proučavanjem vezanosti miksovirusa na umjetne membrane (Tiffany i Blough, 1971.).
C. MOGUĆI MEHANIZMI PRODIRANJA I "TRAGANJA"
Predložena su dva različita "mehanizma za prodiranje i" odstranjivanje "ne samo virusa gripe, već i virusa općenito. Oba stajališta temelje se uglavnom na studijama u elektronskom mikroskopu. Jedan od tih mehanizama je vironeksija, koja Vjeruje se da je to proces ppnocitoze kada su virusne čestice uključene u pinosome, koji se potom spajaju s lizosomima, a enzimi lizosoma uzrokuju da se virus "svuče" (Fazekas de St. Grot, 1948.) Elektronsko mikroskopska potvrda ove točke pogled je dobiven u radovima Dalesa i Choppina (1962.) i Dourmashkina i Tyrrella (1970.). 10 minuta nakon infekcije vidjene su virusne čestice u izravnom kontaktu sa staničnom površinom, a do 20 minuta čestice su pronađene unutar citoplazmatskih vakuola. Za razliku od ove studije, Morgan i Rose (1968) sugeriraju da ulazak može biti posljedica fuzije virusne ovojnice s membranom stanice domaćina. Dakle, trenutno ne postoji konsenzus o mehanizmu prodiranja virusa gripe.
Kako je opisano u pogl. 5, virioni virusa gripe sadrže RNA polimerazu povezanu s njihovim ribonukleoproteinskim komponentama. Stoga je malo vjerojatno da je proces "svlačenja" prostorno odvojen od procesa oslobađanja ribonukleolroteina. A ta se faza odvija na površini stanice, prema mehanizmu membranske fuzije, te u fagocitnim vezikulama, prema mehanizmu viroheksije.
III. TRANSKRIPCIJA A. REDOSLJED SINTEZE RNK
Nakon "svlačenja" sRNA viriona mora se transkribirati u komplementarnu RNA. RNA polimeraza uvedena s inficirajućom česticom mora funkcionirati u prvoj fazi razmnožavanja virusa (vidi Poglavlje 5). Genom virusa gripe može se izolirati iz viriona samo u obliku
pojedinačni ulomci (vidi pogl. 6). Štoviše, funkcionira u obliku - zasebnih fragmenata, kako je pokazala genetska analiza (om. Ch. 7) i postupna inaktivacija infektivnog virusa (Scholtissek, Rott, 1964.) U tom smislu treba pretpostaviti da - polimeraza inicira sintezu RNA u svakom pojedinom fragmentu Budući da RNA ne postoji u stanici kao slobodna molekula, već je uvijek obložena proteinom, postavlja se pitanje: s kojim je proteinom virusna RNA povezana tijekom svoje replikacije?
Eksperimenti provedeni na sintezi RNA virusa gripe predstavljaju velike poteškoće, budući da se aktinomicin D ne može koristiti za otkrivanje proizvodnje virusne RNA uz specifičnu inhibiciju sinteze stanične RNA, budući da ovaj antibiotik inhibira reprodukciju virusa gripe (Barry i sur., 1962.; Rott i Scholtissek, 1964; Barry i sur., 1965; Pons, 1967). Iz tog razloga, da bi se odredio slijed sinteze RNA tijekom vremena, korištena je specifična hibridizacija pulsno obilježene RNA u različitim točkama nakon infekcije s viškom bilo neobilježene vRNA ili ecRNA, nakon čega je slijedio tretman s RNase (Scholtissek i Rott, 1970.) . U ranim fazama infektivnog ciklusa prevladavala je sinteza ecRNA koja je dostigla maksimum oko 2 sata nakon infekcije, dok je u kasnijim fazama većina proizvedene virusno specifične RNA bila vRNA. Krug (1972.), koristeći drugu metodu, također je pokazao da 4 sata nakon infekcije sinteza BIKPHK gotovo potpuno prestaje. Nakon ekstrakcije fenolom nalazi se relativno mala količina lncRNA (Scholtissek i Rott, 1970.).
Zbog činjenice da ova ili ona vrsta virusne RNA ima informaciju1!! funkcionira i koristi se kao predložak za sintezu virusnih proteina (vidi odjeljak IVA), može postojati određena translacijska kontrola na razini diferencijalnog katabolizma virusne RNA. Stoga su provedeni pokusi puls-chase za proučavanje stabilnosti RNK virusa gripe in vivo. Utvrđeno je da su, za razliku od stanične RNA, obje vrste virusne RNA potpuno stabilne tijekom 90-minutnog razdoblja chenza (Scholtissek i sur., 1972.).
Ranije, pri proučavanju sinteze virusne RNA in vivo, kada je aktinomicin D dodan u kasnim fazama infektivnog ciklusa (Duesberg i Robinson, 1967; Nayak, 1970; Ma-hy, 1970), nije uzeto u obzir da antibiotik specifično inhibira sintezu komplementarne RNA in vivo (Scholtissek i Rott, 1970; Pons, 1973). Budući da je lncRNA izolirana iz inficiranih stanica kao najmanje pet zasebnih fragmenata, zaključeno je da se virusna RNA također sintetizira kao fragmenti (Pons i Hirst, 1968.).
B. LOKALIZACIJA SINTEZE VIRALNE RNK UNUTRAŠNJE STANICE DOMAĆINA
Iz podataka dobivenih autoradiografijom, zaključeno je da su mjesto sinteze virusne RNA, po svemu sudeći, stanične jezgre (Scholtissek i sur., 1962; Barry i sur., 1974). Budući da su pulsna razdoblja korištena u ovim studijama još uvijek bila preduga, ne može se isključiti da se virusna RNA sintetizira u citoplazmi stanice i zatim transportira do jezgara gdje se može akumulirati. Osim toga, vRNA i scRNA mogu se sintetizirati u stanici na različitim mjestima.
C. INHIBICIJA SINTEZE VIRALNE RNK 1. Aktimicin D, Mitramicin i α-amanitin
Kada se aktinomicin D ili mitramicin, koji ometaju funkciju DNK šablona, dodaju inficiranim stanicama u vrijeme kada je virusna RNA ovisna RNA iopolimeraza već prisutna (na primjer, 2 sata nakon infekcije), vRNA se nastavlja sintetizirati oko 2 sata produkcija scRNA, međutim, odmah prestaje. Kasnije se sinteza vRNA također smanjuje, što ukazuje da zahtijeva kontinuiranu proizvodnju scRNA (Rott i sur., 1965.; Scholtissek i Rott, 1970.; Scholtissek i sur., 1970.; Pons, 1973.). Gregoriades (1970) je pokazao da aktinomicin D također ima snažan učinak na sintezu vRNA kada se dodaje u kasnom zaraznom ciklusu. U tim pokusima sinteza virusne RNA određena je povećanjem ugradnje obilježenog uridina u ukupnu RNA inficiranih stanica. To povećanje može se ukinuti dodatkom aktinomicina D. Međutim, treba imati na umu da infekcija virusom gripe uzrokuje povećanje ugradnje obilježenog uridina u stanicu nakon infekcije (Scholtissek i sur., 1967.) te da aktinomicin D ima inhibitorni učinak na ovu inkorporaciju (Scholtissek et al., 1969). siAmanitin, koji nema afiniteta za DNA, utječe na aktivnost jedne od staničnih RNA polimeraza (RNA podimeraza II), također inhibira sintezu escRNA kada se doda u tekućinu kulture neposredno nakon infekcije (Rott i Scholtissek, 1970; Mahy i sur. ., 1972).
Mehanizam po kojem ovi antibiotici specifično inhibiraju sintezu ssRNA nije u potpunosti razumljiv, jer ne ometaju stvaranje ssRNA in vitro. Dakle, ovi antibiotici djeluju samo in vivo, iako se enzim koji sintetizira ssRNA može izolirati iz stanica koje dosegnu nakon 2. h nakon infekcije, dodan je aktinomicin D (Scholtissek i Rott, 1969a).
Reprodukcija "virusa gripe može se potisnuti i drugim djelovanjem na DNK stanice domaćina - uvođenjem mitomcina C, predtretiranjem ultraljubičastim zračenjem ili uklanjanjem staničnih jezgri prije infekcije (Barry, 1964; Rott i sur., 1965; Nayak , Rasmussen, 1966; Fol-.lett i sur., 1974; Kelly i sur., 1974). Mehanizam kojim ovi učinci utječu na replikaciju virusa gripe može "biti isti kao i kod drugih antibiotika. Jedina sugestija" koja se može iznijeti iz ovih studija je da postoji potreba za "funkcionalno" aktivnim staničnim jezgrama i (ili) u DNK ovisna funkcija stanice za reprodukciju virusa gripe. Nemoguće je reći koje su to funkcije.
2. Cikloheksimid
Kada se doda cikloheksimid, koji specifično inhibira sintezu proteina u životinjskim stanicama, 2 h nakon infekcije virusom gripe, stvaranje vRNA odmah prestaje, dok se stvaranje vzhRNA nastavlja još najmanje 2 h (Scholtissek i Rott, 1970; Pons, 1973.). Još nije poznato je li potrebna kontinuirana sinteza virusnog ili "staničnog" proteina koji se koristi kao "kvaliteta/kofaktor za polimerazu koja sintetizira vRNA" ili je potreban neki "protein (na primjer, NP protein) za stabilizaciju novosintetizirana vRNA, ili suzbijanje sinteze određenog virusnog proteina dovodi do kontinuiranog stvaranja ecRNA, čija se sinteza normalno gasi 3 sata nakon infekcije. Ovo gašenje može biti potrebno za pokretanje sinteze vRNA. Studije s mutantima osjetljivim na temperaturu trebale bi odgovoriti na neka od ovih pitanja.
Eksperimenti Beana i Simpsona (1973) pokazali su da in vivo primarna transkripcija (sinteza ecRNA na šabloni mRNA pomoću polimeraze inficirajuće čestice) nije potisnuta cikloheksimidom, dok aktinomicin D potpuno potiskuje transkripciju. Dakle, cikloheksimid ne utječe in vivo na aktivnost polimeraze unesene inficirajućom česticom i koja sintetizira ecRNA, ali inhibira sintezu nove polimeraze potrebne za proizvodnju ecRNA.
3. Glukozamin
Poznato je da glukozamin iscrpljuje UTP bazen u stanicama pilećih embrija stvaranjem UTP-]M-acetilglukozamina (Scholtissek, 1971.). Kada se Earleova otopina koja sadrži glukozu koristi kao medij kulture, on
utječe samo na sintezu virusnih glikoproteina (vidjeti dio V). Međutim, ako se glukoza kao izvor energije zamijeni liruvatom ili fukozom, tada se iscrpljivanje UTP bazena ovim amino šećerima događa otprilike 10 puta aktivnije. U tim uvjetima, UTP skup stanice domaćina postaje specifični limitator brzine sinteze vRNA, dok sinteza (stanične RNA) još nije zahvaćena (Scholtissek, 1975.) Kao rezultat supresije sinteze virusne RNA , stvaranje virusnih proteina također je odsutno.
Ovi se podaci mogu tumačiti na dva načina: ili virusna RNA-ovisna RNA polimeraza ima nizak afinitet za UTP u usporedbi sa staničnom DNA-ovisnom "i RIC polimerazom, ili postoje dva manje ili više neovisna skupa UTP-a u stanici, jedan od kojih se "može koristiti za sintezu virusne RNA i više je pod utjecajem glukozamina nego drugi skup, koji se može koristiti kao supstrat RNA polimerazama.
D. SINTEZA VIRUSNE RNK IN VITRO
U stanicama zaraženim virusom gripe, nekoliko istraživača je pronašlo RNA-ovisnu RNA polimerazu (Ho, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969; Ruck i sur., 1969; Mahy, Bromley, 1970; Compans , Caliguiri, 1973.). Većina aktivnosti enzima nalazi se u mikrosomskoj frakciji inficiranih stanica. U in vitro sustavu, ovu aktivnost uklanja RNaza, ali ne i DNaza. To znači da je unutarnji šablon RNA.Reakcija zahtijeva prisutnost sva četiri nukleozid trifosfata i osjetljiva je na aktinom-icin D. Većina proizvodnje reakcije in vitro ima nisku relativnu molekularnu težinu. Podaci Horisbergera i Guskeyja (1973) sugeriraju da su u citoplazmi prisutne dvije različite aktivnosti enzima: jedna je ovisna o Mg++ i inhibirana je relativno visokim koncentracijama soli, druga je ovisna o Mn++ i otpornija na soli. Posljednja aktivnost enzima također se nalazi unutar virusne čestice (vidi Poglavlje 5).
Dobiveni su oprečni rezultati u odnosu na produkt citoplazmatskog enzima u in vitro sustavu. Ruck ■ i sur. (1969) izvijestili su da u njihovim rukama ovaj enzim sintetizira barem "neke od RNA tipa virion (od 14 do 19S). Autori su do ovog zaključka došli prilikom određivanja baznog sastava proizvoda u in vitro sustavu nakon inkubacije mikrosomalna frakcija sa sva četiri obilježena nukleozid trifosfata poznate specifične radioaktivnosti.
na adenilnu kiselinu susjeda dobivenih u istom radu korištenjem [(a-32P]ATP) u skladu su s podacima analize najbližeg susjeda koju je dobio Scholtissek (1969.), na temelju koje je zaključeno da proizvod u in vitro sustav ima strukturu escRNA Mahy i Bromley (1970.) u svojoj izvornoj publikaciji također navode da neki od proizvoda u in vitro sustavu koji proizvodi citoplazmatski enzim mora "biti esRNA. Međutim, nedavno su Hastie i Mahy ( 1973) u analizi najbližeg susjeda i specifičnoj hibridizaciji potvrdili su proizvodnju gotovo isključivo scRNA od strane citoplazmatskog enzima, kao što je prvi pokazao Scholtissek (1969). manje od 90% od kojih ima baznu sekvencu komplementarnu svRNA. Hastie i Mahy ( 1973) "utvrdio da značajan postotak proizvoda u sustavu ieme in vitro, sintetiziran nuklearnim enzimom u prisutnosti aktinomicina D, nije se mogao hibridizirati s neobilježenom vRNA. Još nije jasno koja vrsta RNA nije sposobna za takvu hibridizaciju. Vrlo mali udio RNA sintetizirane u ovim uvjetima hibridizira se s neobilježenom acRNA (Scholtissek, neobjavljeni podaci).
Kinetika ugradnje obilježenog GTP-a u virusnu RNA može se protumačiti kao naznaka da nema ponovnog pokretanja sinteze RNA u in vitro sustavu. Ako se sirovi enzimski pripravak inkubira pri niskim koncentracijama soli, gotovo sva novosintetizirana RNA u početku je jednolančana. Međutim, nakon ekstrakcije fenolom, "veliki postotak RNA postaje otporan na RNAazu. Fenol pretvara strukturu intermedijarne replikacije, koja se sastoji od jednolančane šablone i novosintetizirane scRNA koju molekula polimeraze drži zajedno na mjestu replikacije, u djelomično dvolančana struktura (Feix i sur., 1967; Oberg i Philipson, 1971). Ovi podaci o produktu enzima virusa gripe u in vitro sustavu mogu se protumačiti na način da polimeraza ne samo da pokreće i nastavlja polimerizaciju, već odvaja novosintetizirani lanac od svog šablona. Inače nastaje dvolančana RNA struktura, koja nema "biološke funkcije" (Paffenholz, Scholtissek, 1973). ).
Korišteno je ovo svojstvo RNA polimeraze virusa gripe da sintetizira isključivo scRNA u in vitro sustavu
Pozvan da se uspostavi genetski odnos različitih sojeva virusa gripe određivanjem homologije u baznoj sekvenci između njih (Scholtissek, Rott, 1969b; Hobson, Scholtissek, 1970; Anschutz i sur., 1972).
IV. SINTEZA VIRUSNIH PROTEINA
A. IN VITRO PRIJEVOD
Problem koji tip RNA - je li virionska ili komplementarna - "informativan za sintezu virusnih proteina, još nije riješen. Dobiveni su suprotstavljeni rezultati u pogledu vrste virusno specifične RNA povezane s polisomima. Nayak (1970. ) nalazi se u polisomalnom području gradijenta saharoze, uglavnom vRNA, dok je Pons (1972.) isključivo izolirao scRNA iz polizama. Potonje je potvrđeno opažanjem da nakon dodavanja 2 sata nakon infekcije aktinomicin D, koji prvenstveno utječe na sintezu scRNA (vidi odjeljak III, B, 1), u polisomima inficiranih stanica, ecRNA nije otkrivena (Pons, 1973.).
Koristeći "sustav za sintezu proteina iz E. coli i influenca vRNA kao šablonu, Siegert i sur. (1973) promatrali su proizvodnju virusnog NP proteina u uvjetima in vitro. Ovaj obilježeni NP protein karakteriziran je metodom precipitacije Ouchterlony gelom. Nasuprot tome, Kingsbury i Webster (1973.) nisu primijetili nikakvu sintezu virusnih proteina iz vRNA koristeći sustav za sintezu proteina izveden iz retikulocita kunića. Međutim, u istom sustavu su pronašli sintezu virusnog M-proteina (Vol. Ch. 2) na RNA šablonu izoliranom iz inficiranih stanica. Dakle, trenutno je nemoguće odgovoriti na pitanje koriste li se kao predlošci za sintezu proteina samo viriope ili samo komplementarni, ili neki RNA fragmenti jednog tipa i neki fragmenti RNA drugog tipa. virusima gripe je teško primijeniti definiciju "negativnog" ili "pozitivnog" virusnog lanca, kao što je predložio Baltimore (1971).
B. SINTEZA VIRUSNIH PROTEINA IN VIVO
Proučavanju sinteze virusnih "proteina" pogoduje činjenica da se u inficiranoj stanici sinteza staničnih polipeptida zamjenjuje sintezom specifičnom za virus. U stanicama fibroblasta pilećeg embrija inficiranih HPV-om (Joss i sur., 1969; Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973) i u stanicama BHK 2IF inficiranih WSN sojem virusa gripe (Lasarowitz et al., 1971), 4 sati nakon infekcije, gotovo
samo jedan virusni protein (31). Nešto raniji istraživači promatrali su sintezu tri ili četiri polipeptida u zaraženim krpeljima (Taylor i sur., 1969.; Joss i sur., 1969.; Holland i Kiehn, 1970.; White i sur., 1970.). Kasnije su otkriveni i drugi polipeptidi (Lazorowitz i sur., 1971; Skehel, 1972; Klenk i sur., 1972b; Krug i Etkind, 1973). Općenito, svi strukturni α-proteini pronađeni su u inficiranim stanicama: jedan ili dva P-proteina, nukleokapoidna podjedinica NP, membranski protein M, hemaglutinijev glikoprotein u necijepljenom (HA) i cijepanom (HA1 i HA2) obliku i NA podjedinica .
Osim virionskih proteina, opisani su jedan ili dva nestrukturna proteina (NS).
Postoje značajne razlike<в уровнях синтеза отдельных вирусных полипептидов. NP- и NS-полипептиды обычно первыми обнаруживаются в зараженных «летках. Skehel (1973) предположил, что полипептиды Р2, NP и NS, которые первыми обнаруживаются в «клетках, зараженных ВЧП, являются
produkti RNA fragmenata koji nastaju tijekom selektivne transkripcije virion polimerazom triju fragmenata virusnog genoma. Kada su stanice inficirane u prisutnosti cikloheksimida i dodana pulsna oznaka nakon uklanjanja antibiotika, pronađena su samo ova tri polipeptida. Na temelju toga pretpostavljeno je da su molekule RNA za ove komponente nastale uz pomoć unesene virion lolimeraze u procesu primarne transkripcije. Od 4. do 6. sata nakon infekcije pilećih fibroblasta MPS povećava se razina sinteze M-proteina, dok se sinteza NS-lolileptida smanjuje (Skehel, 1972., 1973.). Stoga se razine sinteze jolipida mogu individualno kontrolirati i mogu varirati tijekom ciklusa rasta.
Osim cijepanja HA polipeptida na HA1 i HA2, nema dokaza da virus specifični polipeptidi gripe nastaju cijepanjem velikih prekursora (Taylor i sur., 1969; Lazarowitz i sur., 1971, Skehel, 1972; Klenk , Rott, 1973.).
Nedavno su dobivene nove informacije o lokalizaciji virusnih komponenti u inficiranim stanicama korištenjem autoradiografije (Becht, 1971) ili tehnika frakcioniranja stanica i gel elektroforeze (Taylor i sur., 1969, 1970). Prema tim studijama, sinteza svih virusnih proteina očito se odvija u citoplazmi. Prethodne studije lokalizacije nukleoproteinskog antigena imunofluorescencijom tumačene su kao naznake da se sinteza događa u jezgri s naknadnim otpuštanjem antigena u citoplazmu (Liu, 1955; Breitenfeld i Schafer, 1957; Holtermann i sur., 1960). Međutim, jasno je da imunofluorescencija određuje nakupljanje antigena, a ne njegovu sintezu (vidi odjeljak IV, B, 2).
1. RNA polimeraza
Aktivnost RNA-polimeraze ovisna o virusu može se otkriti u stanicama inficiranim virusom gripe između 13D i 3h nakon infekcije, ovisno o korištenom staničnom sustavu (Scholtissek i Rott, 1969a; Skechel i Burke, 1969; Ruck i sur.). ., 1969; Mahy i Bromley, 1970). Ovo je prva otkrivena aktivnost specifična za virus nakon infekcije. Većina virusne aktivnosti lolimeraze otkrivena je u mikrosomskoj frakciji; dio te aktivnosti ostaje u jezgrama i odatle se ne može ukloniti čak ni intenzivnim pranjem. Nema temeljnih razlika u kinetici manifestacije ili u potrebnim kofaktorima između nuklearnih i mikrosomalnih enzima (Scholtissek i Rott, 1969a; Mahy i sur., 1975).
Daljnjim frakcioniranjem citoplazme u postupnom gradijentu saharoze metodom Caliguirija i Tamma (1970.), aktivnost polimeraze se nalazi u grubim membranama (Compans i Caliguiri, 1973.; Klenk i sur., 1974.a).
Budući da je aktivnost virusne polimeraze pronađena u pročišćenim virusnim česticama (vidi poglavlje 5), postavlja se pitanje s kojim se od virusnih "proteina" može povezati. Jedini virus specifičan proizvod povezan s aktivnošću polimeraze bio je RNP antigen (NP protein plus virusna vRNA, određen fiksacijom komplementa). Svi pokušaji uklanjanja RNA iz ovog kompleksa rezultirali su potpunim gubitkom aktivnosti enzima (Schwarz i Scholtissek, 1973.). P-protein je predložen kao kandidat za ulogu virusne polimeraze (Kilbourne i sur., 1972.). Kada je enzimski "kompleks obilježen in vivo aminokiselinama" izoliran iz stanica inficiranih virusom gripe i pročišćen oko 35 puta, elektroforetska analiza u početku je otkrila samo Np-bijelu u ovom kompleksu.< (Compans, Caliguiri, 1973). Впоследствии, однако, при других условиях введения;метки удалось обнаружить и Р-белок (Caliguiri, Compans, 1974). С другой стороны, Klenk и соавт. (1974) обнаружили Р-белок в цитоплазматическом золе, "который не обладает полимеразной активностью (Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). Эти наблюдения могут означать, что Р-белок осуществляет свою (Предполагаемую активность ферментов только при связывании с РНП-антигеном.
Malo je vjerojatno da sam RNP antigen ima aktivnost polimeraze, budući da hiperimuni serum protiv RNP antigena ne inhibira aktivnost polimeraze, dok je rekonvalescentni serum, koji može sadržavati antitijela na polimerazu, inhibira (Scholtissek i sur., 1971.). Ovaj rekonvalescentni serum (koji je dobiven od životinja koje su bile zaražene virusima gripe A) inhibirao je aktivnost polimeraze svih proučavanih sojeva virusa gripe A, ali nije inhibirao aktivnost polimeraze virusa influence B. Sva su ta opažanja u skladu s idejom da RNP-antigen (BPHK + NP = = protein), može poslužiti kao predložak za sintezu ecRNA-
2. Nukleokapsidni protein
NP protein se veže na virusnu RNA, tvoreći RNP antigen.To vrijedi za NP protein izoliran ne samo iz viriona, već i iz inficirane stanice (Schafer, 1957.).
otprilike 3 sata nakon infekcije, jedan sat prije pojave hemaglutinina (Breitenfeld, Schafer, 1957). Nakon tog vremena, titar RNP antigena se ne povećava značajno. To može biti posljedica ravnoteže između nove sinteze i ugradnje u zrele čestice. Prema naljepnici, NP protein se može otkriti u inficiranim stanicama unutar 2 sata nakon infekcije (Scholtissek i Rott, 1961; Krug, 1972).
Uz pomoć fluorescentnih antitijela, RNP antigen se najprije otkriva u jezgrama. Kasnije se pojavljuje i u citoplazmi (Breitenfeld i Schafer, 1957.). Pod određenim uvjetima, kao što je abortivna infekcija (Franklin, Brietenfeld, 1959.), u prisutnosti p-fluorofenilalanina (Zimmer-mann, Schafer, 1960.), ili pod uvjetima von-Magnusovog fenomena (Rott, Scholtissek, 1963.), RNP -antigen ostaje u jezgrama.
Rano nakupljanje RNP antigena u jezgrama inficiranih stanica ne znači da se NP protein također sintetizira unutar jezgri. Autoradiografske studije, kao i korištenje metoda frakcioniranja stanica, ukazuju na citoplazmatsku sintezu ovog i drugog proteina bogatog argininom i njihov brzi transport iz citoplazme u jezgre (Taylor i sur., 1969., 1970.; Becht, 1971.).
U ekstraktima inficiranih stanica određeni dio RNP antigena sadrži ecRNA (Pons, 1971; Krug, 1972; Krug i Etkind, 1973), iako se samo jedna vrsta RNA nalazi u virusnim česticama (što proizlazi iz odsutnosti bilo kakvog samohibridizacija vRNA) (Scholtissek, Rott, 1971; Pons, 1971). Nije moguće odlučiti ima li RNP antigen koji sadrži ecRNA specifičan značaj u procesu razmnožavanja virusa ili je to samo artefakt koji se pojavljuje u procesu frakcioniranja stanica. Pokazalo se da se oba RNA lanca jednako dobro vežu na NP protein in vitro (Scholtissek i Becht, 1971.). Dakle, ako postoji bilo koji slobodni NP protein i slobodna scRNA, odgovarajući RNP antigen se odmah formira tijekom procesa homogenizacije. Virion RNA može se istisnuti iz RNP antigena polivin "Ilsulfat O" M (Pons et al., 1969). Stoga se može ispitati je li supstitucija različitih virusnih RNA u RNP antigenu u staničnim homogenatima izvediva. Iz promjena u sastavu baza virusne RNA obilježene u različitim vremenskim razdobljima s 32P i izoliranih iz citoplazmatskog RNP antigena, Krug (1972) zaključuje da neki dio ecRNA, prije nego što je uključen u RNP antigen, postoji u oblik bez NP- vjeverica. Ugradnja 32P u RNA životinjskih stanica događa se sa značajnim kašnjenjem zbog prilično sporog ugrađivanja obilježenog fosfora "u" (x-položaj nukleozid trifosfata (Scholtissek, 1965). Dok se ne izvrše odgovarajuće prilagodbe za izračunavanje promjena u sastavu
razlozi nisu navedeni, podatke Kruga (1972) treba tumačiti s oprezom.
Krugova (1972.) kinetička analiza "pojave RNP antigena u jezgri i citoplazmi" sugerira da RNP antigen koji se nakuplja u jezgrama nije prekursor RNP antigena koji se nalazi u citoplazmi.
3. Nestrukturni proteini
Za inficirane stanice opisano je nekoliko nestrukturnih proteina specifičnih za virus nepoznate funkcije. Jedan od njih, s relativnom molekularnom težinom od 25 000, akumulirajući se u "velikim količinama, označen je kao NS (Lazarowitz et al., 1971). U poliakrilamidnim gelovima ima brzinu migracije blisku mobilnosti M proteina. Međutim , čini se da su oba proteina neovisna jedan o drugom, što se vidi iz razlika u njihovim peptidnim mapama. Velike "količine NS-" proteina pronađene su u jezgrama (Lazarowitz et al., 1971; Krug, Etkind, 1973) Ovi nalazi su u skladu s podacima prethodnih imunofluorescentnih studija Dimock (1969), koji je uočio "svijetlo bojenje jezgri s antiserumom specifičnim za nestrukturne virusne antigene, a ovo bojenje vjerojatno odražava prisutnost NS-" proteina. otkriveno je da je ovaj protein također glavni protein specifičan za virus u frakcijama slobodnih i na membranu vezanih ribosoma izoliranih iz inficiranih stanica (Pons, 1972; Compans, 1973; Klenk i sur., 1974a). Čini se da povezanost NS-a s ribosomima ovisi o tonaži (Krug i Etkind, 1973.). U puferima s niskom ionskom snagom, OVAJ nolipaptid adsorbirao se na obje ribosomske podjedinice, dok je dodavanjem soli iz njih uklonjen.
Nedavna studija (Gregoriades, 1973.) izazvala je sumnje u identifikaciju NS-a kao nestrukturnog polipeptida različitog od polipeptida virion M. iz cijelih inficiranih stanica, α-jezgri ili polisoma. Analiza triptičkih produkata M-proteina, također kao nuklearni i β-proteini povezani s ribosomom, dovelo je do mnogih podudarnosti, sugerirajući da su M- i NS-proteini identični. Potrebne su, međutim, dodatne informacije za uvjerljivo objašnjenje ovih rezultata.
Osim NS-a, mogu postojati i druge nestrukturne komponente specifične za virus, iako nijedna od njih. nije dovoljno okarakteriziran. Korištenjem antiseruma usmjerenog protiv nestrukturnih virusnih antigena,
Dimmock i Watson (1969) istaložili su radioaktivno obilježene polipeptide iz inficiranih stanica. Elektroforetska analiza u poliakrilamidnom gelu sugerira prisutnost nekoliko nestrukturnih polipeptida s glavnom komponentom koja odgovara NS. Jedna od preostalih nestrukturnih komponenti migrira brže i može odgovarati komponenti relativne molekularne težine od 10 000 do 15 000 koju su opisali Skehel (1972), Krug i Etkind (1973).
4. Membranski M-protein
M-protein, koji "oblaže unutarnju površinu lipidnog dvosloja ovojnice i bogat je virionom, nalazi se u inficiranim stanicama u relativno malim količinama. To ukazuje ne samo na mogućnost kontrole sinteze M-belma, već i mogućnost da je ova sinteza faza koja ograničava brzinu razmnožavanja virusa (Lazarowitz i sur., 1971.) Ovaj koncept podržavaju podaci da na temperaturi od 29 °C, pri kojoj je stvaranje virusa potisnuto, M -protein je jedini (virusopedski) protein koji se ne može otkriti u inficiranim stanicama (Klenk, Rott, 1973.).
M-protein (može se naći na glatkim i plazma membranama inficiranih stanica (Lazarowitz i sur., 1971; Corn-pans, 1973a; Klenk i sur., 1974a). Ovi podaci ukazuju na afinitet ovog proteina za membrane.
5. Hemaglutinin
Hemaglutinin se sintetizira kao veliki glikoprotein - prekursor HA, koji se potom cijepa na dva manja glikoproteina: HAi i HA2" (Lazarowitz" t al., 1971). Cijepanje, koje se može potisnuti inhibitorima proteaze, Rott (Klenk, Rott 1973), provodi se očito proteolitičkim enzimima stanice domaćina (Lazarowitz i sur., 1973.) Stupanj cijepanja ovisi o soju virusa, stanici domaćinu, stupnju citoiatskog učinka i prisutnosti ili odsutnosti seruma u medij (Lazarowitz i sur., 1971, 1973a, b Klenk i Rott 1973 Stanley i sur. serum U prisutnosti seruma, međutim, WSN hemaglutinin se također cijepa.
Sustav se odvija na plazma membrani (Lazaro-witz i sur., 1973a). U sustavu VChP, mehanizam takvog cijepanja, očigledno je drugačiji. Cijepanje se "događa na intracelularnim membranama, a plazminogen u ovom slučaju nije neophodan (Shchepk i sur., 1974a). Stupanj cijepanja naglo opada tri 25 °C (Klenk, Rott, 1973).
Cijepanje HA nije neophodan uvjet za hemaglutinacijsko djelovanje i sastavljanje viriona (Lazarowitz i sur., 1973a; Stanley et al., 1973), ali su nedavne studije "utvrdile da je to neophodno za infektivnost (Klenk et al., 1975b). ) Ovi podaci su u skladu s hipotezom da, osim svoje uloge u adsorpciji, HA* ima još jednu funkciju u infektivnom procesu i da je za tu funkciju potrebno cijepanje. stanice domaćina i da su čestice koje sadrže nerazcijepljeni HA niske infektivnosti sugeriraju da raspon domaćina i širenje infekcije virusom gripe ovise o prisutnosti proteaze stanice domaćina kao aktivirajućeg enzima.
U pokusima frakcioniranja "stanica inficiranih s
virusa influence, ustanovljeno je da su HA glikoproteini uvijek ak
povezan s membranama (Compans, 1973a; Klenk i sur.,.
1974a). Unutarstanična lokalizacija ovih proteina i njihov trenutak
voki-toki od grubih membrana do glatkih endolazmatskih
retikuluma i na plazma membrane bit će de
su detaljno opisani u odjeljku VII, B. . .,
6. Neuraminidaza
Pronađen je virusni NA* kao aktivni enzim,
3 sata nakon infekcije u horion-alantoičnoj membrani
nah, a ekstrapolacijom je ustanovljeno da je početak njezina sin
teza se javlja 1-2 sata nakon infekcije (Noll et al.,
1961). Intracelularnu lokalizaciju NA* proučavao je
frakcioniranje stanica, i otkrio da je očito
mu, slično lokalizaciji HA* (Compans, 1973a; Klenk i sur.,
1974a). NA* je pronađen u vezi s membranama,
potječe iz glatkog endoplazmatskog retikuluma
pri određivanju biološkom aktivnošću i analizom
zu u poliagrilamidnom gelu. Pronađena je aktivnost enzima
den također u frakcijama koje sadrže hrapave membrane
nas. Ovi podaci su u skladu s onima dobivenim s
imunofluorescencija (Maeno, Kilbourne, 1970). Nakon 4 sata
nakon infekcije, yairaminidaza se može otkriti u cito
plazma; kasnije se čini da se koncentrira na peri
stanična ferija.
V. SINTEZA UGLJIKOHIDRATA
Ugljikohidrati sudjeluju u stvaranju glikoproteina i glikolida ovojnice virusa gripe (Klenk i sur., 1972a). Glikolipidi miksovirusa (izvedeni iz plazma membrana stanice domaćina (Klenk, Choppin, 1970), „nije utvrđeno što je pretežno (uključeno u virion: već postojeći ili novosintetizirani glikolipidi.
Korištenje radioaktivnih prekursora kao što su glukozamin, manoza, galaktoza i fukoza, koji su specifično ugrađeni u virusne glmkopeltide, pokazalo je da se ugljikohidratni bočni lanci ovih glikopeptida ponovno sintetiziraju tijekom infekcije (Haslam i sur., 1970; Cornpans et al., 1970a; Schwarz i Klenk, 1974). Eksperimenti frakcioniranja stanica dali su dodatne informacije o mjestima glikozilacije virusnih glikoproteina Glukozamin je povezan s HA polipeptidom u frakcijama i glatkih i grubih citoplemičkih membrana; međutim, fukoza je povezana s HA u glatkim, ali ne i grubim membranama (Compans, 1973b Supresija sinteze proteina puromicinom gotovo odmah zaustavlja ugradnju glukozamina, dok se fukoza nastavlja inkorporirati oko 10-15 minuta (Stanley i sur., 1973.).<и НА2 содержат, по-видимому, полный состав маннозы « глюкозамина, тогда как содержание фукозы и галактозы значительно выше в продуктах расщепления (Klenk et al., 1975a; Schwarz, Klenk, 1974). Эта наблюдения предполагают, что биосинтез углеводных боковых целей гликопротеинов НА осуществляется по стадиям с различными остатками Сахаров, добавляемыми в разных участках клетки. Глюкозамин и манноза (присоединяются, по-видимому, к полипептидам НА на шероховатых мембранах вскоре после или даже в процессе синтеза поляпептида, в то время как фукоза, вероятно, прикрепляется позже с помощью трансфераз, присутствующих в гладких мембранах.
Ove glikoziltransferaze su vjerojatno stanični enzimi. Posljedično, ugljikohidrat (dio glikoproteina očito određuje stanica domaćin. Međutim, postoje dokazi da, osim ovih enzima stanice domaćina, virusna NA* igra značajnu ulogu u stvaranju bočnih lanaca ugljikohidrata. utvrđeno je da na površini ovojnica miceovirusa nedostaje neuraminska kiselina (Klenk i Choppin, 1970b; Klenk i sur., 1970), dok je u virusnim ovojnicama koje ne sadrže ovaj enzim ovaj ugljikohidrat čest sastojak (Klenk i Choppin, 1971. ; McSharry i Wagner, 1971; Renkonen i sur., 1971) Ovi podaci sugeriraju da
Djelovanje neuraminske kiseline bitno je obilježje miksovirusa. Nedavno je pokazano da je NA* odgovoran za uklanjanje neuraminske kiseline iz ovojnice virusa gripe, čime se sprječava stvaranje receptora na ovojnici virusa koji bi inače doveli do stvaranja velikih agregata virusnih čestica (Palese i sur., 1974. Ovi podaci podupiru koncept da je ugljikohidratni dio HA* kao glavnog površinskog glikoproteina proizvod kombiniranog djelovanja (staničnih transferaza i virusnog NA*. Svojim djelovanjem virus može uvesti modifikaciju specifičnu za virus u (Inicijalno specifičnu za domaćina, složenu strukturu za modifikaciju ugljikohidrata, koja je, prema očito bitna za -biološku aktivnost virusa.
D-glukozamin i 2-deoksi-0-glk>koza inhibiraju stvaranje biološki aktivnih HA*, NA* i infektivnog virusa (Kilbourne, 1959.; Kaluza i sur., 1972.). Biokemijske studije su pokazale da se ti šećeri natječu s biosintezom virusnih glikogroteina (Ghandi i sur., 1972; Klenk i sur., 1972b). U prisutnosti ovih inhibitora smanjuje se veličina glikoproteina HA. Stupanj redukcije ovisi o dozi. Dakle, s povećanjem koncentracije šećera, glikoprotein HA s relativnom molekulskom težinom od 76 000 postupno prelazi u spoj molekulske mase od 64 000, koji je označen kao HA0 (Klenk et al., 1972b; Schwarz, Klenk, 1974) Pomak molekularne težine paralelan je sa smanjenjem sadržaja ugljikohidrata i pokazalo se da protein HA0 gotovo ne sadrži ugljikohidrate (Schwarz, Klenk, 1974). Ovi rezultati pokazuju da je HA0 nepotpuno glikoziliran ili neglikoziliran polipeptidni lanac HA glikoproteina i da je "inhibicijski učinak D-glukoza amina a i 2-deoksi-0-glukoze posljedica oštećenja glikozilacije. HA0 polipeptid je povezan s membranama, poput normalne HA. Također migrira iz grubog u glatki ejadoplastični retikulum, gdje se cijepa na polipeptide HA01 i HA02. vjerojatno nije bitno za afinitet ovog polipeptida za membranu. Međutim, nedostatak hemaglutinacijske aktivnosti u inficiranim stanicama sugerira da se ne-glikozilirani protein ne može vezati na receptore.
VI. SINTEZA LIPIDA
Kao i svi virusi s ovojnicom, virus gripe dobiva svoje lipide korištenjem lipida stanice domaćina. Ovaj stav potvrđuju sljedeća zapažanja.
Denia. Utvrđeno je da je sastav lipida virusa gripe sličan onom u stanici domaćinu (Ambruster i Beiss, 1958; Frommhagen i sur., 1959). Lipidi stanice domaćina, radioaktivno obilježeni prije infekcije, ugrađeni su u virusne čestice (Wecker, 1957.). Prilikom uzgoja virusa u različitim stanicama domaćinima, otkrivaju se modifikacije virusnih lipida (Kates i sur., 1961., 1962.). Općenito, lipidi virusa (koji pupolje s površine stanice usko odražavaju lipidni sastav plazma membrane stanice domaćina (Klenk i Choppin, 1969; 1970a, b; Renko-nen et al., 1971). osfolilidi u fibroblastu pilića stanice su ostale nepromijenjene 7 sati nakon infekcije virusom gripe, nakon čega je sva sinteza lipida potisnuta (Blough i sur., 1973.). Ova supresija vjerojatno nije primarni učinak, a može biti sekundarna u odnosu na inhibiciju RNA ili sintezu proteina, odnosno na ".druge citolitičke učinke.
Dakle, na temelju do sada dobivenih rezultata može se pretpostaviti da se sinteza virusnih lipida odvija kroz normalne stanične procese biosinteze lipida, a virusna ovojnica nastaje ugradnjom lipida iz plazma membrane stanice domaćina.
VII. MONTAŽA (vidi također 2. poglavlje)
A. STVARANJE NUKLEOKAPSIDA
Kao što je već spomenuto, najvjerojatnije je da se nukleokapsidni protein sintetizira u citoplazmi. Očito je tamo kratko vrijeme prisutan u slobodnom obliku, a zatim se povezuje s virusnom RNA, tvoreći nukleokapside (Klenk i sur., 1974.; Compans i Caliguiri, 1973.). Budući da se NP protein brzo ugrađuje u nukleokapside, RNA se može odabrati iz n-reformiranog skupa (Krug, 1972). Zbog male veličine nukleokapsida virusa gripe, oni se ne mogu točno identificirati u inficiranim stanicama pomoću elektronske mikroskopije. Skupine niti ili vlakana promjera oko 5 nm, uočene u citoplazmi, vjerojatno predstavljaju virusne ribo-nukleoproteine (Apostolov i sur., 1970; Compans i sur., 1970b).
Dostupni podaci pokazuju da se RNA genom viriona virusa gripe sastoji od 5-7 fragmenata (vidi Poglavlje 6).
Stoga svaka infektivna čestica treba barem jednu kopiju svakog fragmenta. Hirst (1962.) pre-
sugerirao da se nukleokapsidi iz intracelularnog skupa mogu uključiti u (virione slučajno. Udio "infektivnih viriona u E populaciji može se povećati uključivanjem dodatnih fragmenata RNA u prosječni virus (Compans et al., 1970). Na primjer, ako pet različitih RNA fragmenata, svaka virna sadrži ukupno 7 fragmenata uključenih u virusni slučaj, tada bi otprilike 22% viriona trebalo biti zarazno. Dokazi za nasumično uključivanje RNA fragmenata potkrijepljeni su nedavnim zapažanjima Hirsta (1973.) da se u virusnoj populaciji rekombinacija događa između čestica koje ne stvaraju plak. Sposobnost takvih čestica da sudjeluju u rekombinaciji može se objasniti odsutnošću jednog ili više fragmenata u česticama, dok se fragmenti koji nedostaju mijenjaju od jedne čestice do druge , stoga, prikladna gnijezda defektnog virusa mogu formirati rekombinante.
B. PROCES PUPANJA VIRUSA
Poput većine virusa s ovojnicom, virus gripe se okuplja na prethodno oblikovanim staničnim membranama; montaža se vrši pupanjem iz plazma membrane. Prvu demonstraciju oslobađanja virusa iz "stanice procesom koji nije uključivao lizu" predstavili su Murphy i Bang (1952) u ranim studijama elektroničke mikroskopije stanica inficiranih virusom gripe. ■ sferične strukture. Tijekom stvaranja "zaraznog virusa" unutar stanica nisu uočene virusne čestice i stoga je bilo jasno da se virusne čestice stvaraju na površini stanice. Koristeći antitijela obilježena feritinom, Morgan i sur. virusni antigen u tim područjima gdje nastaje virus.Kasnije studije elektronske mikroskopije pokazale su da površina virusa koji pupa sadrži istu membranu kao i stanica domaćin sa slojem izbočina koje odgovaraju virusnim "šiljcima" na vanjskoj površini. Na površini virusne membrane , na površini stanice nedostaje dodatni elektronski gust sloj koji se vjerojatno sastoji od M-iolipeptida (Bachi i sur., 1969.; Compans i Dimmock, 1969.; Apostolov i sur., 1970.).
Studije elektronskim mikroskopom dale su osnove za ■ sugerirati redoslijed kojim su virusne komponente as-
socijalizirati na staničnoj membrani (Bachi i sur., 1961; Compans i Dimmock, 1969; Compans i sur., 1970b).
Prvo se pojavljuju proteini virusne ovojnice, koji su uključeni u neke regije membrane, koje bi trebale imati normalnu morfologiju; međutim, opažena specifična adsorpcija eritrocita na ta područja membrane ukazuje na prisutnost HA proteina ovdje. Tada se, očito, M-protein (povezuje s unutarnjom površinom takvih područja membrane, tvoreći sloj gust elektronima. Nadalje, ribo-nukleoprotein se specifično veže za membranu u tim područjima i proces pupanja se događa savijanjem i izbočenje segmenta membrane i okolni ribonukleoprotein. Podaci elektroforeze u poliakrilamidnom gelu također podržavaju ideju da se proteini ovojnice povezuju s plazma membranom brže od RNP-a (Lazarowitz et al., 1971.) nalaze se u pročišćenim virionima. Kao što je već spomenuto, Ostaci neuraminske kiseline su odsutni u ljusci čestica virusa gripe koji pupaju, ali su prisutni u susjednim dijelovima stanične membrane (Klenk i sur., 1970.).
Ovi podaci dokazuju oštar prijelaz u kemijskom sastavu između ljuske virusne čestice koja pupa i susjedne stanične membrane.
Međutim, s druge strane, važna značajka procesa pupanja je da je virusna ovojnica kontinuirana s plazma membranom stanice domaćina i morfološki joj je slična (Compans i Dimmock, 1969.). Kao što je spomenuto, lipidi u ovim membranama vrlo su slični lipidima membrane stanice domaćina. Ova opažanja sugeriraju da se lipidi u intaktnoj plazma membrani lako izmjenjuju s lipidima u virusnim česticama koje pupaju radijalnom difuzijom.
Stoga, ovojnica viriona koji pupa nastaje od malog dijela stanične membrane modificiranog da uključuje proteine ovojnice viriona. Ovaj koncept, naravno, ne podrazumijeva potrebu za sintetiziranjem svih komponenti ovojnice na plazma membrani.
Doista, već dugo je poznato da komponente ovojnice moraju migrirati na značajne udaljenosti od jednog staničnog mjesta do drugog kako bi došle od mjesta svoje biosinteze do mjesta sklapanja membrane. Breitenield i Schafer (1957) pokazali su da se u stanicama zaraženim virusom gripe, HA* može prvo vidjeti
staviti u sve dijelove stanice i da je lokalizirana u perinuklearnoj zoni u povećanoj -koncentraciji. Kasnije se HA* akumulira u "perifernoj regiji" zareza, a može se pokazati i u tankim filamentima koji strše iz flare membrane.
Ideja da komponente ovojnice migriraju iz unutrašnjosti stanice na površinu nedavno je potvrđena i proširena nizom studija korištenjem frakcioniranja stanica i analize virusnih proteina u različitim staničnim frakcijama. Ovi radovi također sugeriraju da se HA glikoprotein, a možda i drugi proteini ovojnice, sintetiziraju na grubom endoplazmatskom retikulumu (Compans, 1973a; Klenk i sur., 1974). Kao što je otkriveno u eksperimentima praćenja pulsa, nakon nekoliko minuta, HA se već nalazi u membranama glatkog endoplazmatskog retikuluma (Compans, 1973a; Stanley i sur., 1973; Klenk et al., 1974) i u plazma membrani (Stanley et al., 1973). Iako nisu provedeni pokusi za potjeranje od glatkog endoplazmatskog retikuluma do plazma membrane, čini se vjerojatnim da HA migrira iz grubog endoplazmatskog retikuluma do plazma membrane, zaobilazeći glatki endoplazmatski retikulum. Valja napomenuti da su tijekom cijelog vremena takve migracije HA i drugi proteini ovojnice sastavni dijelovi membrana duž kojih se kreću; OBI se nikada ne nalaze kao otopljeni proteini.
Frakcije glatkih membrana, za koje se smatra da prvenstveno potječu od endoplazmatskog retikuluma, sadrže sve glavne proteine ovojnice (Compans 1973a; Klenk i sur., 1974). Međutim, njihove se relativne količine ovdje razlikuju od onih u plazma membrani i virionu (Stanley i sur., 1973.; Klenk i sur., 1974.). Omjer M-proteina i NA likoprotektora veći je u ovojnici zrelog viriona nego u membranama endolazmatskog retikuluma. Ovi podaci sugeriraju da se samo mali broj membrana koje nose HA glikoprotein pretvaraju u virusnu ovojnicu, odnosno frakcije membrana koje sadrže proteine bez ugljikohidrata. Kao što je već spomenuto, sinteza M-proteina može biti faza koja ograničava proces sastavljanja virusa.
Razlika u brzini sinteze različitih proteina ovojnice podržava "hipotezu da je sastavljanje ovojnice višestupanjski proces. Pitanje procesa stvaranja HA*, uključujući sekvencijalno dodavanje ugljikohidratnog dijela i proteolitičko cijepanje tijekom migracije primarnog genskog produkta, u skladu je s ovim konceptom.
VIII. OSLOBAĐANJE VIRUSA GRIPE
Problem oslobađanja virusa gripe iz stanice domaćina,
čini se da je usko povezan s problemom funkcije virusa
NA*, o čemu je već ranije bilo detaljno razmotreno (vidi
slučajevi V i pogl. četiri). Da ovaj enzim igra bitnu ulogu
ulogu u oslobađanju virusa, proizašla iz sposobnosti anti
tijela specifična za NA* za suzbijanje takvog oslobađanja (Se-
do, Rott, 1966.; Webster i sur. G968). Štoviše, ova antitijela
spriječiti eluiranje virusa iz eritrocita (Brown, Laver,
1968). Bakterijski NA* koji nije inhibiran anti-antitijelima
lamy do virusnog NA*, može osloboditi virus iz stanica,
tretirani takvim antitijelima (Compans et al., 1969.;
Webster, 1970.). S druge strane, dvovalentna antitijela
do NA također uzrokuju agregaciju virusa (Seto, Chang, 1969;
Compans i sur., 1969; Webster, 1970), dok je monovalentna anti
tijela ne sprječavaju oslobađanje virusa, iako inhibiraju
preko 90% aktivnosti neuraminidaze (Becht i sur., 1971).
Svi ovi podaci zajedno upućuju na to
dvovalentna antitijela sprječavaju oslobađanje virusa
vežući ga na antigene prisutne na
stanične površine, te inhibiranjem aktivnosti fer
policajac. Uloga neuraminidaze u oslobađanju probirnog virusa
ili također Palese i sur. (G974), koji je utvrdio da ovaj fer
ment je neophodan za uklanjanje neuroamilne kiseline iz vi
Ruska površina kako bi se izbjegla agregacija viriona - tada -
uvale na površini ćelije.
IX. NEISPRAVNI OBLICI UZGOJA
A. ABORTIVNA REPRODUKCIJA OVISNA O STANICI DOMAĆINU
Virusi gripe mogu zaraziti širok raspon stanica domaćina. Međutim, u mnogim zaraženim stanicama, prinos infektivnog potomstva je ili vrlo nizak ili se ne može detektirati, iako se virusne komponente mogu otkriti u normalnim titrima.Ova vrsta prekida infektivnog ciklusa ovisnog o stanici domaćina naziva se abortivna infekcija. inficirani u mozgu ne-neurotropnim sojevima virusa gripe (Schlesinger, 1953). Što je veća doza virusa primijenjena, veća je količina novosintetiziranog hemaglutinina. Nekoliko drugih sustava virusa gripe A stanica-domaćin opisano je u koji je proizveden samo RNP-I.antigen i hemaglutinin, ali ne i zarazni virus.U svim tim do sada proučavanim sustavima RNP-antigen se nakupio u jezgri i nije detektiran.
detektiran je fluorescentnim antitijelima u citoplazmi (Henle i sur., 1955.; Franklin i Breitenfeld, 1959.; Ter Meulen i Love, 1967.; Fraser, 1967.).
B. FENOMEN VON MAGNUS
Tijekom serijskih prolaza "virusa gripe s brojnošću većom od 1 (Barry, 1961.), stvaraju se sve veće količine nepotpunog virusa koji izlaze iz stanice domaćina (von Magnus, 1951., 1952.). Te virusne čestice imaju površinu struktura vrlo slična strukturi infektivnog virusa, imunogeni su i uzrokuju homolognu interferenciju, sadrže manje RNA i RNP antigena, pokazuju niži omjer infektivnosti prema hemaglutinacijskoj aktivnosti i sadrže više lipida od cjelovitih virusnih čestica (von Magnus, 1954.; Isaacs, 1959; Pauker i sur., 1959; Rott i Schafer, 1961; Rott i Scholtissek, 1963).
U analizi RNA nekompletnog virusa utvrđeno je da virusna RNA s relativno velikom [molekularnom masom ili nema ili je prisutna u njima u smanjenim količinama, dok se količina RNA niske molekularne mase povećava (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969; Nayak, 1969).
U stanicama inficiranim drugim nerazrijeđenim prolazom virusa gripe, sve genetske informacije virusa su prisutne, budući da je ecRNA izolirana iz tih "stanica" sposobna pretvoriti, nakon hibridizacije, označenu RNA izoliranu iz infektivnog virusa u potpuno RNA-azorezistivan oblik (Scholtissek, Rott, 1969b). Dakle, povećanje količine RNK niske molekularne mase u nepotpunim česticama može biti posljedica RNA visoke molekularne mase, koja se može uključiti u te čestice u obliku uništenih i stoga nefunkcionalnih molekula. Ovu ideju podupiru dokazi da se s žednim nerazrijeđenim prolazom sposobnost proizvodnje infektivnog virusa najprije smanjuje, nakon čega se smanjuje sinteza hemaglutinina, neuraminidaze i konačno RNP antigena (Scholtissek i sur., 1966.).
Nayak (1972) je otkrio da je tijekom prvog prijelaza s velikom multiplicitnošću virus koji se pojavio na početku bio potpuno zarazan i dao je normalan uzorak infektivnih virusnih RNA fragmenata u gradijentu saharoze, dok je virus koji se pojavio kasnije imao RNA profil tipičan za nepotpuni (pozadinski -magnus) virus1.
Oni su obvezni unutarstanični paraziti, što znači da se ne mogu replicirati ili prenijeti svoje gene bez pomoći. Sama pojedinačna virusna čestica (virion) je inertna. Kada virus inficira stanicu, koristi enzime i većinu stanične strukture za replikaciju.
Za razliku od onoga što vidimo u procesima stanične diobe kao što je , virusna replikacija proizvodi mnogo potomaka koji uništavaju stanicu domaćina, a zatim inficiraju druge stanice u tijelu.
Virusni genetski materijal
Virusi mogu sadržavati jedno-/dvolančanu DNK ili RNA. Vrsta genetskog materijala koji se nalazi u određenom virusu ovisi o njegovoj prirodi i funkciji. Točna priroda onoga što se događa nakon što je domaćin zaražen varira ovisno o prirodi virusa.
Proces replikacije za viruse s dvolančanom DNA, jednolančanom DNA, dvolančanom RNA i jednolančanom RNA bit će drugačiji. Na primjer, dvolančani DNA virusi obično moraju ući u stanice domaćina prije nego što se mogu replicirati. Međutim, jednolančani RNA virusi repliciraju se uglavnom u stanicama domaćinima.
Nakon što virus inficira domaćina, komponente virusnog potomstva proizvode se staničnim strojevima, a sastavljanje virusne kapside je neenzimski proces. Virusi obično mogu zaraziti samo ograničen broj domaćina. Mehanizam "brava i ključ" najčešće je objašnjenje za ovaj fenomen. Određeni proteini na virusnoj čestici moraju odgovarati određenim receptorskim proteinima na površini stanice određenog domaćina.
Kako virusi inficiraju stanice?
Glavni proces infekcije i replikacije virusa odvija se u 6 faza:
- Adsorpcija – virus se veže na stanicu domaćina.
- Ulazak – virus unosi svoj genom u stanicu domaćina.
- Replikacija virusnog genoma – Virusni genom se replicira pomoću stanične strukture domaćina.
- Sklapanje - nastaju virusne komponente i enzimi, koji se počinju sastavljati.
- Sazrijevanje - virusi se razvijaju iz sastavljenih komponenti.
- Izlaz – novi virusi izbijaju iz stanice domaćina u potrazi za novim žrtvama zaraze.
Virusi mogu zaraziti bilo koju vrstu stanica, uključujući
KOD GRIPE IRIS: DOGAĐAJI I PREDVIĐANJA
D.K. Lvov, A.D. Zaberežni, T.I. Aliper
Dmitrij Konstantinovič Lvov, akademik Ruske akademije medicinskih znanosti, direktor Istraživačkog instituta za virusologiju po imenu A.I. DI. Ivanovsky RAMS, voditelj Odjela za virusologiju Moskovske medicinske akademije. IH. Sečenov. Voditelj projekta 05-04-52136, 06-04-48822.
Aleksey Dmitrievich Zaberezhny, doktor bioloških znanosti, voditelj Laboratorija za molekularnu dijagnostiku istog Instituta, voditelj Odjela za molekularnu biologiju NPO Narvak.
Taras Ivanovič Aliper, doktor bioloških znanosti, voditelj Laboratorija sredstava za specifičnu prevenciju virusnih bolesti istog Instituta, ravnatelj NPO Narvak.
Vidi prvu objavu članka: Priroda. 2006. broj 6. str. 3–13.
Epidemije gripe javljaju se svake godine i ne doživljavaju se kao nešto izvanredno. Budući da je bolest uzrokovana virusima koji su već poznati imunološkom sustavu, to
obično se dobro slažu. Pandemija je druga stvar: u ovom slučaju uzročnik gripe je virus s novim antigenskim i biološkim svojstvima, koji se brzinom munje širi svijetom, zahvaća do četvrtine stanovništva planeta i oduzima desetke milijuna života. Ova "poznata" pandemija prošlog stoljeća. Bilo ih je nemoguće predvidjeti, kao što je, međutim, nemoguće imenovati točno vrijeme početka novog.
Međutim, sada je, zahvaljujući stalnom praćenju virusa koji kruže među ljudima, domaćim i divljim životinjama, kao i spoznajama dobivenim molekularno genetskim metodama, već moguće predvidjeti pojavu novih varijanti virusa s pandemijskim tendencijama. Posljednjih godina identificiran je kandidat za tu ulogu: krajem 2003. prvobitno nepatogeni ptičji virus H5N1 izazvao je epizootiju gripe među domaćim pticama, koja se ove godine pretvorila u panzootiju. Ovaj virus je počeo zaraziti i druge životinje, uključujući ljude, ali se do sada ne može prenijeti s osobe na osobu. Da bi stekao tu sposobnost, dovoljno je zamijeniti samo jednu aminokiselinu u jednom od virusnih proteina.
Virionske strukture
Virus gripe ima prilično jednostavnu strukturu: to je sferna čestica (virion) promjera oko 0,13 mikrona, u jezgri, koja sadrži nukleokapsid (molekula RNA pakirana u ljusci proteina M1), okružena lipidom. membrana (slika 1). U tu su membranu uronjena tri proteina - hemaglutinin, neuraminidaza i ionski kanal (protein M2), koji imaju glavnu ulogu u infektivnom procesu.
Hemaglutinin je prvi koji dolazi u kontakt s receptorima stanice domaćina. Na površini virusne ovojnice predstavljen je u obliku vrlo složenih trimera. Svaki njihov monomer čvrsto je usidren u membrani i sadrži dvije podjedinice – jedna od njih osigurava primarni kontakt s ciljnom stanicom, druga je odgovorna za fuziju virusne i stanične membrane. U gornjem dijelu proteina nalaze se mjesta koja se vežu na sijaličnu kiselinu, koja je dio receptora stanice domaćina.
Enzim neuraminidaza cijepa terminalne skupine sijalinske kiseline staničnih receptora, uslijed čega stanica gubi sposobnost prepoznavanja antigena, a virus prodire
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
ulazi u nju endocitozom, uobičajenim načinom dostave tvari u stanicu. Kisela okolina endosoma nastalog iz stanične membrane aktivira ionski kanal M2, koji snižava pH unutar virusne čestice, što dovodi do uništenja ljuske proteina M1. Istodobno se aktivira hemaglutinin. Sintetizira se u obliku prekursora, koji u kiseloj sredini prelazi u zrelo stanje - cijepa se proteolitičkim enzimima na dvije podjedinice, dok fuzijski peptid skriven unutar trimera mijenja konformaciju, oslobađa se, pomiče se na gornji kraj. molekule i unosi se u membranu. Virusna ovojnica se spaja s endosomskom, stvara se fuzijska pora kroz koju se otvara put stranom genetskom materijalu u citoplazmu. Virusna RNA tada ulazi u staničnu jezgru. Kao rezultat toga, vitalni procesi su poremećeni u stanici, a ona sama, koristeći vlastite resurse, počinje proizvoditi virusne proteine. Virusna RNA se odmah replicira i sastavljaju nove virusne čestice koje se uz pomoć neuraminidaze oslobađaju iz oštećenih stanica (proizvodi njihova raspadanja uzrokuju intoksikaciju tijela i grozničavo stanje) te se krvotokom raznose po cijelom tijelu.
Slika 1. Shema viriona virusa gripe. Njegova lipoproteinska membrana prekrivena je bodljama od dva glikoproteina - hemaglutinina i neuraminidaze. Unutra je nukleokapsid, molekula RNA omotana u ljusku proteina M1. Genom se sastoji od osam fragmenata, od kojih prvih šest kodira po jedan protein (hemaglutinin - HA, neuraminidaza - NA, podjedinice RNA polimeraze - PB1, PB2, PA, nukleoprotein
NP), a posljednja dva gena - dva proteina s jedinstvenim amino sekvencama.
bez kiselina (matriksni proteini - M1, M2 i nestrukturni proteini - HS1, HS2).
Virus koji se razmnožava deprimira hematopoetski i imunološki sustav, oštećuje endotel kapilara, što dovodi do povećane vaskularne propusnosti i krvarenja do cerebralnog edema sa smrtnim ishodom. Ali to se događa prilično rijetko, obično se aktivira imunološki sustav - prvo su uključeni čimbenici urođene (nespecifične) imunosti, a nakon nekog vremena počinju se proizvoditi specifična antitijela koja oslobađaju i nakon ponovne infekcije štite tijelo od virusa.
Posebnost virusa gripe je velika varijabilnost antigenskih svojstava. Unutarnji proteini su konstantne strukture i određuju vrstu virusa (A, B i C). Površinski antigeni su, naprotiv, heterogeni i varijabilni, i to u većoj mjeri
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
penisa, radi se o hemaglutininu (H), koji zajedno s neuraminidazom (N) određuje podtip virusa (H1N1, H2N2, H3N2 itd.). Antigenska varijabilnost površinskih proteina posljedica je dvaju genetskih procesa - promjena i promjena u genomu virusa.
Promjene su uzrokovane točkastim mutacijama u genima koji kodiraju hemaglutinin i neuraminidazu, a dovode do manjih promjena u strukturi tih proteina. U pravilu se takve promjene događaju između pandemija kod svih vrsta virusa (A, B i C). Zbog toga se svake godine javljaju epidemije, a ne pandemije, jer se zaštita od prijašnjeg izlaganja virusu održava, iako je nedovoljna.
Promjene pomaka nastaju nakon potpune zamjene gena. To je moguće jer je genom virusa gripe segmentiran – sastoji se od osam fragmenata jednolančane linearne RNA, koji kodiraju, uz hemaglutinin i neuraminidazu, enzim specifičan za virus (RNA polimerazu, ili transkriptazu, koja se sastoji od tri podjedinice – proteina PB1, PB2, PA), kao i nukleoprotein (NP), matriks (M1 i M2) i nestrukturni (NS1 i NS2) protein. Kada je stanica istovremeno inficirana s dva različita soja, segmenti njihovih replicirajućih genoma miješaju se u bilo kojoj kombinaciji, tako da novi virioni sadrže različite skupove gena posuđenih od svakog od izvornih virusa. Takva kombinacija segmenata virusne RNA naziva se genetsko miješanje, odnosno reasortiranje, što se ne smije miješati s već postojećim pojmom - rekombinacija, tijekom koje se genetski materijal preuređuje ili crossover mehanizmom ili kao rezultat promjene šablona. Promjene pomaka, u pravilu, utječu na antigenu strukturu hemaglutinina, rjeđe - neuraminidazu. Tako se u nepravilnim razmacima (10-40 godina) pojavljuju virusi s novim antigenskim i biološkim svojstvima, uključujući nove pandemijske varijante.
Vrsna barijera
Među virusima koji mogu izazvati ekstremne epidemijske situacije, protiv kojih je u fazi njihovog nastanka otežana ili čak nemoguća borba, posebno su opasni virusi gripe A. Odlikuju se visokom antigenom heterogenošću površinskih proteina i zastupljeni su prema nomenklatura, po 16 neuraminidaze (N1-9). Ovi virusi su rašireni u prirodi i mogu zaraziti sve vrste ptica i neke vrste sisavaca (ljudi, konji, svinje, kitovi, tuljani itd.). Infekcija sisavaca javlja se uglavnom kroz dišne puteve, ptica - kroz crijeva. Njihova infekcija obično je asimptomatska ili u obliku enteritisa, što ukazuje na visok stupanj međusobne prilagodbe virusa gripe i divljih ptica, koje se mogu smatrati njihovim prirodnim domaćinima. Virus perzistira u vodi, na +22°C - do mjesec dana, na +4°C i niže - dulje vrijeme (6-8 mjeseci), stoga je vodeno-fekalni put infekcije glavni mehanizam za održavanje stalne cirkulacije virusa gripe u prirodi.
Unatoč antigenskoj heterogenosti, virusi sa svim poznatim kombinacijama površinskih proteina izolirani su samo od divljih ptica vodenih i poluvodenih kompleksa - pataka, galebova itd. (slika 2).
Među ostalim životinjama cirkuliraju samo virusi s određenim skupom površinskih proteina: na primjer, virusi samo tri podtipa hemaglutinina (H1-H3) i dvije neuraminidaze (N1-N2) su donedavno izolirani od ljudi. Sve četiri pandemije 20. stoljeća nastali su zbog novih varijanti promjena ovih podtipova: „španjolska gripa” 1918. uzrokovana je virusom gripe A podtip H1N1, „azijska gripa” 1957. – H2N2, „hongkonška gripa” 1968. – H3N2 i „ruski gripa” 1977. - H1N1. Svi su reassortants virusa ptičje i ljudske gripe.
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
Donedavno se vjerovalo da virusi ptičje gripe nisu patogeni za ljude i da, ako su zaraženi, mogu uzrokovati samo konjuktivitis i blagu slabost, u rijetkim slučajevima i blagi respiratorni sindrom. Međutim, 1997. godine virusi H5N1 prouzročili su iznimno tešku bolest među ljudima u Hong Kongu - od 18 oboljelih, šest ih je umrlo, a svi su se zarazili od pilića. Druga slična epizoda dogodila se u veljači 2003., također u Hong Kongu - od pet zaraženih, dvoje je umrlo. Virusi H5N1 povremeno su izolirani iz pilića i drugih vrsta ptica (uključujući divlje ptice) u lokalnim populacijama.
sl.2. Shema cirkulacije poznatih podtipova virusa gripe A.
Virus serotipa H9N2, koji je raširen među peradi u Kini i drugim azijskim zemljama, otkriven je u pet Kineza u kolovozu 1998., a godinu dana kasnije u Hong Kongu kod dvije djevojčice s bolešću nalik gripi. Važno je napomenuti da su se svi slučajevi bolesti javljali neovisno jedan o drugom, a prijenos virusa s osobe na osobu nije uočen. 1996. godine, virus ptičje gripe H7N7 izoliran je od žene s konjuktivitisom. Jedan slučaj u Nizozemskoj završio je smrću. To su samo oni slučajevi koji su službeno zabilježeni, ali u stvarnosti virusi ptičje gripe prevladavaju barijeru vrste, očito mnogo češće i počinju zaraziti ne samo ljude, već i druge životinje (svinje, konje, kitove, kune itd.) . Poznati su slučajevi zaraze domaćih ptica (kokoši, purana) virusima gripe karakterističnim za divlje ptice, posebice ptice vodene.
Još uvijek je teško pouzdano procijeniti sve čimbenike koji ograničavaju raspon domaćina virusa, te mehanizme koji utječu na promjenu domaćina. Takva se potraga provodi, i to već duže vrijeme, u raznim istraživačkim skupinama, uključujući i naš institut.
Hemaglutinin je bio prvi na koji se posumnjalo, jer je upravo taj glikoprotein odgovoran za prepoznavanje receptora stanice domaćina i uključen je u fuziju virusne ovojnice s endosomom (u stvari, dijelom citoplazmatske membrane stanice domaćina). Struktura ovih receptora razlikuje se ovisno o vrsti i tkivnom podrijetlu stanica. Te su razlike važne u ograničavanju prijenosa virusa između vrsta i posebno su istražene u vezi s pojavom novih humanih pandemijskih virusa.
Utvrđeno je da receptori epitelnih stanica ljudskog respiratornog trakta, osim proteina, sadrže ugljikohidrate - sijalooligosaharide, u kojima je terminalna sijalinska kiselina (N-acetilneuraminska kiselina) vezom 2'-6' povezana s galaktozom. i stanične receptore
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
crijevni epitel ptica - 2'-3'. Virusi ptičje gripe ne razmnožavaju se dobro kod ljudi jer se jednostavno ne mogu vezati na ljudske receptore. Istodobno, mucini (po prirodi isti složeni glikoproteini sa sijalinskom kiselinom na kraju), koji su potrebni za zaštitu ljudskih pluća od mikroorganizama, sadrže receptore s 2'-3' galaktoznom vezom. Dakle, virus ptičje gripe koji slučajno uđe u ljudsko tijelo ne može prodrijeti u stanice, budući da na njihovoj površini nema specifičnih receptora, a mucin blokira prepoznavanje aktivnosti virionskih receptora, pa čovjeku u ovom slučaju prijeti samo blago curenje iz nosa.
Ali u ovom slučaju, kako objasniti pojavu pandemijskih varijanti virusa? Situacija se malo razjasnila kada se doznalo da stanice dišnog trakta svinja nose obje vrste receptora i, sukladno tome, mogu se zaraziti i virusima ljudske i ptičje gripe. To znači da svinje potencijalno mogu poslužiti kao posredni domaćini za razne viruse i idealno mjesto za njihovo reasortiranje u mješovitim infekcijama.
S obzirom na hemaglutinin, čini se da je njegova sposobnost prepoznavanja receptora stanice domaćina prvenstveno povezana sa strukturom mjesta za vezanje receptora (PCS). Dakle, u virusima ljudske gripe PCC sadrži aminokiseline leucin i serin na pozicijama 226 i 228, dok su kod ptičjih virusa ti položaji glutamin i glicin. Druge aminokiselinske supstitucije pronađene su u PCC-u kod različitih životinja, što znači da iako je PCC očuvan i evolucijski stabilan, još uvijek ima promjenjive regije koje utječu na vezanje receptora (afinitet) i specifičnost.
RCC se može promijeniti nakon što virus prevlada barijeru među vrstama, dok virusi ptičje gripe, na primjer, mogu steći sposobnost prepoznavanja receptora ljudskih stanica. Dokaz da se barijera između ptica i ljudi može prevladati je izbijanje ljudske gripe u Hong Kongu 1997. uzrokovano ptičjim virusom H5N1.
Pretpostavlja se da je "vezivanje" virusa za domaćina određeno ne samo karakteristikama hemaglutinina, već i drugog površinskog proteina - neuraminidaze. Osim toga, postoji razlog vjerovati da su geni unutarnjih i nestrukturnih proteina virusa gripe A uključeni u ograničavanje raspona domaćina. Međutim, prerano je govoriti o tome, budući da je još potrebno proučiti doprinos svaki gen i funkciju njihovih proizvoda. Kako god bilo, važno je razumjeti da čak i minimalne promjene u strukturi virusnih proteina, posebno hemaglutinina, mogu dovesti do značajnih promjena ne samo u rasponu virusa domaćina, već iu stupnju njegove patogenosti (virulencija ).
Virulencija
Podsjetimo da reprodukcija virusa u organizmu domaćina zahtijeva aktivaciju prekursora molekule hemaglutinina; u ovom slučaju, proteaze domaćina ga cijepaju na dvije podjedinice. Proteoliza hemaglutinina niskopatogenih ptičjih virusa događa se u ograničenom broju tipova stanica, pa je virus lokaliziran samo u respiratornom ili crijevnom traktu. To se događa s asimptomatskim ili umjerenim infekcijama. Hemaglutinini visoko patogenih ptičjih virusa razgrađuju se u različitim stanicama i stoga su sposobni uzrokovati smrtonosne sistemske infekcije, osobito u peradi.
U raznim laboratorijima diljem svijeta počeli su proučavati genom sojeva virusa gripe koji su visoko patogeni za ljude (H5N1 i H7N7, izolirani 1997.-2004.). Pokazalo se da ti virusi sadrže nekoliko bazičnih aminokiselina na mjestu cijepanja molekule hemaglutinina, što im osigurava visoku infektivnu aktivnost i patogenost. Za razliku od nepatogenih ili slabo patogenih virusa, koji nemaju ovaj aminokiselinski slijed, hemaglutinin visokopatogenih virusa lako se cijepa ne samo proteazama sličnim tripsinu prisutnim u stanicama ljudskog respiratornog trakta i crijevima ptica, već također proteazama sličnim furinu. Djeluju u kombinaciji
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
s ubikvitinom, dizajniranim za označavanje proteina za proteaze koje je potrebno uništiti. Proteaze slične furinu sintetiziraju se u različitim tkivima, što patogenim virusima daje sposobnost inficiranja različitih sustava i organa. Umetanje čak i jedne bazične aminokiseline na mjesto proteolitičkog cijepanja hemaglutinina dovoljno je da se niskopatogeni virus pretvori u visokopatogen.
Nakon toga, to je potvrđeno u pokusima na miševima zaraženim različitim varijantama (izoliranih u različitim godinama) virusa H5N1. Neki od njih počeli su se razmnožavati u mozgu, jetri, slezeni, krvnim stanicama, uzrokujući 100% smrt miševa sedmi do osmi dan nakon infekcije, dok su drugi virusi bili nepatogeni za miševe i razmnožavali su se samo u plućima. Ubrzo je to objašnjeno - u virusima H5N1 izoliranim 2004. godine, u usporedbi s virusima dobivenim 1997.-2003., otkrivene su dodatne mutacije gena za hemaglutinin, što je utjecalo na promjenu njihovih antigenskih svojstava.
Na patogenost virusa mogu utjecati promjene u strukturi ne samo površinskih, već i unutarnjih proteina. Na primjer, mutacija na poziciji 627 u proteinu PB2 pronađena je u soju virusa gripe H5N1 koji je vrlo patogen za miševe. Upravo je ta mutacija utjecala na razliku u svojstvima dvaju virusa H5N1 izoliranih u Hong Kongu, i kao rezultat toga, rezultat infektivnog procesa. Osim toga, virulentnost ovih virusa gripe povezana je sa strukturnim značajkama nestrukturnog NS proteina, posebice s prisutnošću glutaminske kiseline na poziciji 92 u njegovoj molekuli, što viruse čini otpornima na antivirusni učinak interferona.
Naravno, primjenom suvremenih molekularno-genetskih metoda u proučavanju virusa gripe postupno se rasvjetljavaju njihova biološka svojstva, ali ništa manje važne nisu ni tradicionalne metode koje prate cirkulaciju virusa gripe među ljudima, domaćim i divljim životinjama. Predviđanje pojave reasortanata s pandemijskim tendencijama i razvoj učinkovitih mjera za prevenciju i kontrolu gripe može se razviti samo na temelju proučavanja ekologije i evolucije uzročnika ove teško predvidljive i teško kontrolirane zarazne bolesti. . Takve su studije prije više od 35 godina započeli G. Laver u Australiji, R. Webster u SAD-u, D.K. Lvovu u našoj zemlji, a provode se do danas u cijelom svijetu.
Događaji i prognoze
Svjetska zdravstvena organizacija (WHO) pokrenula je opsežnu studiju virusa gripe A nakon pandemije uzrokovane virusom H3N2 1968. godine. Naš institut je otkrio da je progenitor H3N2 bio soj sličan virusu H3N8 izoliranom u Ukrajini 1963. godine od divljih pataka. Ovi i drugi podaci poslužili su kao osnova za razvoj znanstvenog smjera - ekologija i evolucija virusa gripe A. Stvoren je Nacionalni centar za ekologiju virusa gripe A s mrežom referentnih baza, gdje su dobiveni novi podaci, potvrđujući odsutnost temeljnih razlika između virusa influence A ljudi i životinja, t.e. prisutnost jednog zaštićenog genskog fonda. Prema tim podacima, 1980. godine stvorena je klasifikacija virusa gripe, bez obzira na njihovo podrijetlo. Od tada je svakom izoliranom virusu dodijeljeno ime koje odražava vrstu virusa, izvor izolacije, mjesto i godinu izolacije, kao i podtip - na primjer, A / patka / Ukrajina / 63 (H3N8).
Glavni cilj našeg istraživanja u Rusiji bio je proučavanje evolucije virusa gripe A u procesu interakcije virusnih populacija s populacijama divljih ptica i domaćih životinja te nastajanju sojeva s epidemijskom snagom. Da bi se to postiglo, praćenje se provodi na ključnim točkama u sjevernoj Euroaziji; Izolirano je 14 od 16 poznatih virusa
Krajem 2003. godine, t.j. tri mjeseca prije početka epizootije uzrokovane virusom ptičje gripe H5N1 u zemljama jugoistočne Azije, jedan od autora ovog članka (D.K. Lvov) govorio je na Međunarodnom kongresu gripe u Japanu, najavljujući izolaciju ovih virusa
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
od divljih ptica u Rusiji - na Altaju i na jugu Primorja. Prema molekularno-genetičkim podacima, ovi se sojevi klasificiraju kao nisko patogeni. Zatim je, po analogiji s ranijim opažanjima, napravljena prva prognoza o mogućnosti njihovog unošenja s pticama selicama u peradarne farme jugoistočne Azije, gdje bi se nakon nekog vremena mogle pretvoriti u visokopatogene s panzootskim i pandemijskim potencijalima. Očigledno, to se i dogodilo. Epizootika je u kratkom vremenu zahvatila 10 zemalja. Od tada je ubijeno i zaklano više od 150 milijuna kokoši i pataka. Prema podacima WHO-a, do kraja ožujka 2006. već je zaraženo 185 osoba, od kojih je 104 umrlo. Epizootika se nastavlja, a virusi su prodrli u populacije svinja, što je posebno zabrinjavajuće. Možda je svijet na rubu epidemiološke katastrofe: reasortanti mogu nastati u bilo kojem trenutku kada su svinje istovremeno zaražene ptičjim virusom H5 i ljudskim virusima H1 ili H3 gripe koji kruže svijetom.
Napravljeno je i drugo predviđanje: u slučaju zaraze u zimovališta divljih ptica visoko patogenim sojevima, povećava se rizik od njihovog unošenja na teritorij Rusije, posebno u Sibir i Daleki istok, tijekom proljetnih migracija. A onda se dogodilo nešto što se trebalo dogoditi. Sredinom srpnja 2005. u naseljima Novosibirske regije, koja se nalaze unutar jezerske sjeverne šumske stepe nizine Baraba, otkrivena je epizootika peradi sa stopom smrtnosti od preko 90% i brzim širenjem.
Materijali su prikupljeni od domaćih i divljih ptica koje su živjele u neposrednoj blizini epizootskog mjesta. Koristeći SPEV i MDCK stanične linije (ova nestandardna metoda je trenutno u patentiranju), izolirali smo šest sojeva H5N1 iz peradi i gnjuraca (Podiceps cristatus), s vrlo visokim tkivnim koncentracijama virusa. S prioritetom od 8. kolovoza 2005., ovi sojevi su deponirani u Državnu zbirku virusa, a podaci o sekvenciranju njihovog genoma pune duljine pohranjeni su u GenBank s prioritetom 5. rujna 2005. godine. Mjesto proteolitičkog rezanja hemaglutinina svih dobivenih sojeva sadrži aminokiselinsku sekvencu PQGERRRKKRGLF koja je karakteristična za visokopatogene viruse ptičje gripe. Nukleotidni slijedovi gena hemaglutinina svih analiziranih virusa peradi pokazali su se potpuno identičnimi, ali se razlikuju od soja izoliranog od divlje ptice (čebeti gnjurac), ali samo po dvije nukleotidne supstitucije (Sl. 3). Filogenetska analiza pokazala je visoku razinu homologije hemaglutinina zapadnosibirskih sojeva s sojevima izoliranim u proljeće iste godine iz planinske guske (Anser indicus) na jezeru. Kukunor u sjeverozapadnoj pokrajini Qinghai (NRK). To je u potpunosti potvrdila analiza preostalih sedam gena.
Identitet genetskih karakteristika izoliranih sojeva dokazuje izravnu vezu između virusa koji kruže u populacijama divljih i domaćih ptica. Istodobno, sojevi virusa gripe H5N1 otkriveni 2005. značajno se razlikuju od sojeva ovog virusa izoliranog prethodnih godina, uključujući soj A/Vietnam/1194/2004(H5N1) dobiven iz Engleske, koji se nudi u našoj zemlja za proizvodnju cjepiva. Očito je da se, barem za veterinarsko cjepivo, može koristiti samo soj iz Državne zbirke virusa, koji po antigenskim svojstvima odgovara virusu koji cirkulira u Rusiji.
Soj koji smo izolirali, pohranjen u Državnoj zbirci virusa, već se koristi za proizvodnju cjepiva velikih razmjera na peradarskoj farmi Stavropol. Domaće ptice se cijepe u Južnom federalnom okrugu. Do 15. lipnja 2006. planirana je proizvodnja 15 milijuna doza cjepiva uz daljnje širenje proizvodnje.
Inače, u pandemiji, kada je potrebno brzo uspostaviti proizvodnju cjepiva, preporučljivo je, po našem mišljenju, kao supstrat koristiti stanične linije u kojima se virus gripe brzo nakuplja u visokim koncentracijama. Ova novorazvijena metoda ima značajne prednosti u odnosu na tradicionalnu metodu koja se koristi
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
koriste se pileći embriji: uz zadržavanje svih antigenskih domena hemaglutinina, kulturno cjepivo eliminira pojavu komplikacija povezanih s pilećim proteinom. To je posebno važno u proizvodnji ljudskih cjepiva. Samo trebate znati koji soj treba koristiti za imunizaciju ljudi. To će ovisiti o antigenskoj karakterizaciji rezultirajuće pandemijske varijante. Možda će biti drugačije od ovoga što je sada. U svakom slučaju, korištenje živog cjepiva je apsolutno neprihvatljivo. Genetska interakcija između cjepiva i terenskih virusa može dovesti do reasortanata s nepredvidivim posljedicama.
sl.3. Stupanj srodnosti nukleotidnih sekvenci gena hemaglutinina varijanti virusa gripe A podtipa H5 izoliranih od divljih i domaćih ptica u različitim zemljama u posljednjih 10 godina. Visoko patogeni sojevi H5N1 iz skupine virusa Qinghai-Novosibirsk označeni su podebljanim slovima.
Analiza genoma sojeva koje smo izolirali otkrila je niz značajki povezanih s biološkim svojstvima. Osim aminokiselinskog slijeda proteolitičkog mjesta cijepanja hemaglutinina, koji određuje visoku razinu patogenosti virusa, pronađene su delecije na poziciji 49-68 u neuraminidazi (genotip Z), što ukazuje na povećan tropizam virusa izoliranih nas na perad i potencijalnu patogenost za ljude. Glutaminska kiselina na 92. poziciji proteina NS1 određuje otpornost virusa na djelovanje interferona i povećanu virulenciju za svinje. Lizin na poziciji 627 proteina PB2 objašnjava sposobnost proučavanih sojeva da se razmnožavaju u različitim staničnim linijama sisavaca. Otkrivena svojstva virusa koji je prodro na teritorij Rusije svjedoče o njegovoj visokoj patogenosti u odnosu na domaće ptice i ljude.
Prisutnost serina, a ne asparagina, na 31. poziciji M2 ukazuje na osjetljivost virusa na rimantadin, što se u potpunosti podudara s podacima izravne studije o učinku antivirusnih lijekova na reprodukciju virusa. U te svrhe koristili smo i stanične linije i utvrdili da su za prevenciju i rano liječenje gripe jednako učinkoviti i da se mogu koristiti kao skupi strani lijekovi - na primjer Tamiflu, kao i relativno jeftini domaći koji su dostupni u ljekarne - rimantadin,
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
virazol (s intravenskom i aerosolnom primjenom), arbidol. Nažalost, u zemlji trenutno nema ili je nedostatna proizvodnja ovih lijekova te je hitno potrebno stvoriti njihove strateške zalihe.
Kako i kada je visoko patogeni virus gripe H5N1 ušao u Rusiju i kako će se dalje razvijati?
sl.4. Putevi širenja virusa gripe H5N1 u populacijama divljih i domaćih ptica. Niskopatogeni virusi gripe (LPVV) izolirani iz divljih i domaćih ptica u sjeveroistočnoj regiji Altajskog kraja 1991. i na jugu Primorskog kraja 2001. očito su bili prethodnici izbijanja gripe 1997. u Hong Kongu i epizootijama. u jugoistočnoj Aziji u -2005., kao i u sjeverozapadnoj Kini 2005. Postavši visoko patogeni (HPA), ovi virusi su prodrli tijekom proljetne migracije divljih ptica u Zapadni Sibir, gdje su u ljeto 2005. izazvali izbijanje gripe među peradi. U razdoblju seobe ptica vodenog i poluvodenog kompleksa HPVH se dalje širio na sjever i zapad Euroazije, a u zimu 2006. ovi virusi su već otkriveni u Africi. Debele strelice označavaju infekciju virusom gripe iz divlje prirode
ptica domaćim pticama i obrnuto.
Prvo, nisko patogeni sojevi koji kruže u Sibiru i na Dalekom istoku među divljim pticama uneseni su tijekom jesenskih migracija u zemlje jugoistočne Azije (slika 4.). Pošto su tamo postale vrlo patogene, u proljeće 2005. prodrle su u zapadni Sibir s divljim pticama i naglo se pojačale tijekom razdoblja gniježđenja. Visoko patogeni sojevi raspršili su se s pticama na mjesta gniježđenja na površini od više od 10 milijuna hektara.
km2. Nakon što je virus pogodio populaciju peradi, dogodila se epizootska eksplozija. Ovo je ozbiljno i dugo.
Treće predviđanje je bilo da će ptice ponovno širiti virus, kada se u jesen vrate u svoja zimovališta kroz gusto naseljena područja Rusije i drugih zemalja.
BIOLOGIJA I MEDICINSKA ZNANOST | Virusi gripe: događaji i prognoze |
I tako se dogodilo. U jesen 2005. virus je već stigao do većine europskih zemalja, a pronađen je i u Turskoj, na Krimu, u Iranu, Azerbajdžanu, Gruziji, Indiji, te u Africi. Došli smo do Tule, Kalmikije i delte Volge, gdje je u prosincu 2005. godine nakon kratkog zaustavljanja letećih sjevernih pataka - patkica (Aythya fuligula) izbila epidemija gripe u populaciji nijemog labuda (Cygnusolor). Sojevi izolirani iz labudova, prema njihovoj molekularno-genetičkoj analizi, također pripadaju Qinghai-zapadnosibirskoj skupini virusa. Za pola godine kruženja među divljim pticama sojevi su zadržali svoj genotip i nisu izgubili visoku patogenost.
Četvrta prognoza je najalarmantnija. Virus je zagadio mnoge akumulacije u gnijezdištima i na migracijskim rutama te će tamo ostati do proljeća. Svaka prirodna voda u koju je pao izmet zaraženih ptica pretvara se u “tempiranu bombu”. To se može usporediti s uključenošću tresetišta u požar tajge. U proljeće će se zaražene i zdrave ptice vratiti i proletjeti kroz ta "minska polja", pa bi događaji u ljeto 2006. mogli biti mnogo strašniji nego u protekloj sezoni. To potvrđuje i lavinsko pogoršanje situacije u Europi, Aziji i Africi već u ožujku. Ovo je panzootsko. A kada se visokopatogeni sojevi koji kruže među divljim pticama u proljeće vrate u niskopatogene sojeve, nemoguće je predvidjeti koliko će proces njihovog resortiranja trajati mjesecima ili godinama. Jasno je da je to predmet prioritetnog proučavanja o kojem ovisi razvoj događaja u dogledno vrijeme.
Što se tiče pandemijskog virusa, on može nastati i kod nas nakon zaraze svinja virusima ljudi i ptica. No, najvjerojatnije će nam doći iz Kine, gdje su mogućnosti transformacije reasortanta posebno velike s obzirom na aktivnost epizootskog procesa i ogroman osjetljivi kontingent među populacijom. Kod nas se u svakom trenutku može pojaviti pandemijski virus - za to je dovoljna samo jedna aminokiselinska supstitucija u RCC hemaglutinina, kao rezultat toga, virus će početi prepoznavati receptore ljudskih stanica i, sukladno tome, početi prenositi s osobe na osobu.
Što bi, s naše strane, sada trebalo učiniti na državnoj razini, formulirano je u tablici. Posebnu pozornost posvetit ćemo proučavanju daljnje evolucije visoko patogenih sojeva koji su utjecali na populacije divljih ptica. Ključnu ulogu u tome imaju ekosustavi na teritoriju Rusije. Planiramo nastaviti praćenje u europskom dijelu zemlje, u Sibiru i na Dalekom istoku, a moguće i u nekim susjednim zemljama.
U posljednjih pet godina, naše istraživanje je provedeno zajedno s lovcima, ornitolozima, zaposlenicima saveznih službi fitoveterine i sanitarno-epidemiološkog nadzora Novosibirske, Astrahanske, Irkutske regije, Primorskog teritorija, Birobidžana, republika Kalmikije i Burjatije. . Sve se to odvijalo u okviru saveznih programa “Zaštita od patogena”, “Razvoj sredstava i metoda za suzbijanje bioterorizma”, “Influenca A svinja i ptica: interakcija populacija”.
